乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析

樊惠华 侯磊磊 方莹 柴梅梅

摘 要：为了提升食品检验检测机构对食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力，提高微生物实验室外部质量控制水平。本实验室参加中国检验检疫科学研究院测试评估中心组织的ACAS-PT1108（2021）乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证，参考参试指导书、《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）、海博单增李斯特氏菌成套生化鉴定管和MicroScan WalkAway 40 Plus全自动微生物生化鉴定仪。结果表明，参试样品编号21-T031为单核细胞增生李斯特氏菌，样品编号21-U887未检出单核细胞增生李斯特氏菌，经鉴定为伊氏李斯特氏菌，最终能力验证结果评价为满意，可见本实验室具有成熟的单核细胞增生李斯特氏菌检验能力。

关键词：乳粉;单核细胞增生李斯特氏菌;能力验证

Results and Analysis of the Proficiency Testing of Listeria Monocytogenes in Milk Powder

FAN Huihua， HOU Leilei， FANG Ying， CHAI Meimei

（Yulin Food Inspection and Testing Center， Yulin 719000， China）

Abstract： In order to improve the ability of food inspection and testing institutions to detect Listeria monocytogenes in food and to improve the external quality control level of microbiology laboratory. The laboratory participated in the proficiency testing of Listeria monocytogenes in ACAS-PT1108 （2021） milk powder organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Inspection and Quarantine Sciences. Reference was made to the test guidelines， the GB 4789.30—2016， the complete biochemical identification tubes of Listeria monocytogenes in Haibo and the MicroScan WalkAway 40 Plus automatic microbial biochemical identification instrument. The results showed that the sample number 21-T031 was detected as Listeria monocytogenes， and the sample number 21-U887 was not detected as Listeria monocytogenes， which was identified as Listeria.ivanovii. The final proficiency test results were satisfactory. It can be seen that the laboratory has a mature ability to test Listeria monocytogenes.

Keywords： milk powder; Listeria monocytogenes; proficiency test

李斯特菌屬目前包括17种公认的短杆状革兰氏阳性菌，其中单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌被认为是病原体[1]。单核细胞增生李斯特氏菌会感染人和动物，伊氏李斯特氏菌最初被认为仅感染反刍动物，GUILLET等报道伊氏李斯特氏菌可引起胃肠炎和菌血症，被认为是一种肠道机会性病原体[2]。单核细胞增生李斯特氏菌是一种主要的食源性致病菌，可引起李斯特菌病，表现为胃肠炎、败血症、中枢神经系统感染以及母儿感染，导致流产、死胎、早产或患有新生儿李斯特菌病[3-4]。其广泛存在于自然环境中，能够在低温、酸性pH、高盐浓度等恶劣条件下生存，其中凉拌菜、肉及肉制品、乳与乳制品、动物性水产品等更易受到单核细胞增生李斯特氏菌的污染[5]。

能力验证是食品检验检测机构质量控制的重要手段。由于各类食品中单核细胞增生李斯特氏菌的污染报道不断涌现，在每年的质量控制计划中应覆盖单核细胞增生李斯特氏菌等致病菌的比例，至少每年一次，利用能力验证评估食品实验室的检验能力。榆林市食品检验检测中心因CNAS认可的需要，组织参加中国检验检疫科学研究院测试评估中心组织的ACAS-PT1108（2021）乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证。在依据国标的前提下，从样品水化处理到全自动微生物生化鉴定仪结果分析，每个实验环节积累经验，保持本实验室致病菌的检验检测能力以及对即将展开的榆林市市售肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌的污染状况研究项目奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

实验用的乳粉样品由中国检验检疫科学研究院测试评估中心提供，两个样品，编号分别为21-T031和21-U887，白色冻干块状，为人工污染的乳品样品，包装于真空西林瓶内。

1.2 培养基与试剂

李氏增菌肉汤（LB1，LB2）基础及添加剂、李斯特氏菌显色培养基、PALCAM琼脂培养基、0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、革兰氏染色试剂盒、7%羊血琼脂基础及脱纤维羊血及单增李斯特氏菌成套生化鉴定管等相关配套试剂，均产自青岛海博生物技术有限公司;革兰氏阳性细菌鉴定及药敏板PC33，产自美国贝克曼库尔特公司。

1.3 仪器设备

BXM-75V立式高压蒸汽灭菌器，上海博讯公司;BXS-250可扩展试验箱，上海博讯公司;HFsafe 1500TE生物安全柜，上海三申公司;DM2000生物光学显微镜，德国徕卡公司;MicroScan WalkAway 40 Plus 全自动微生物生化鉴定仪，德国西门子公司。

1.4 标准菌株

实验用阳性对照菌和阴性对照菌分别为单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC 19148）、斯氏李斯特氏菌（CICC 21671）、伊氏李斯特氏菌（CICC 21663）、英诺克李斯特氏菌（CICC 10417）、马红球菌（CICC 22955）和金黄色葡萄球菌（CICC 23656），均已完成菌株形态学鉴定和生化鉴定。

1.5 实验方法

1.5.1 检验依据

根据能力验证参试指导书对两个样品进行单核细胞增生李斯特氏菌定性检验，检验依据为GB 4789.30—2016第一法。同时以MicroScan WalkAway 40 Plus全自动微生物生化鉴定仪作为辅助，用来分析鉴定可疑菌株，综合以上实验结果进行最终报告。

1.5.2 样品水化处理

样品处理参考作业指导书要求进行，整个水化过程在生物安全柜内完成。本次能力验证样品复原后等同于60 mL的待测乳品样品。

1.5.3 增菌

因样品可能存在致病性，所有实验过程在BSL-2实验室生物安全柜内进行。依据单核细胞增生李斯特氏菌检验标准进行LB1和LB2增菌（两次增菌），为保证实验的准确性，可设计两个平行，两名检验员同时进行。对增菌结果拍照留存，同时做空白对照。

1.5.4 选择性分离

分别用两个培养基品牌（环凯和海博）的李斯特氏菌显色平板和PALCAM琼脂平板进行划线分离，同时用标准菌株单核细胞增生李斯特氏菌以及其他李斯特氏菌，如伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌及英诺克李斯特氏菌作为对照菌株，初步观察菌落形态。

1.5.5 初筛

选择上述平板上的可疑菌落，接种于木糖、鼠李糖发酵管，同时在TSA-YE平板上划线，选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

1.5.6 形态学鉴定及生化实验

对TSA-YE平板上的可疑单菌落分别进行染色，镜检，并按照海博单增李斯特氏菌成套生化鉴定管说明书进行相关实验。同时快速用接种针挑取TSA-YE平板上培养18～24 h的单菌落，于30 mL稀释液中，摇匀，转移至PC33药敏板上，随后进行用MicroScan WalkAway 40 Plus全自动微生物生化鉴定仪鉴定。

2 结果与分析

2.1 选择性分离

编号21-T031和21-U887的样品经一次增菌后，因乳粉本身的干扰因素，不能判断是否有微生物生长;二次增菌后，21-T031样品的培养基略微浑浊，21-U887样品的培养基呈澄清状态，不能判断出是否有微生物生长。将二者的LB2增菌液分别在PALCAM及李斯特显色培养基上划线分离，两个样品在两种分离平板上至少划线两个以上，同时划线单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC 19148）和其他李斯特氏菌作为对照菌。结果发现，样品21-T031在PALCAM平板上呈现圆形、灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，无其他明显干扰菌;在李斯特氏菌显色平板上为蓝色菌落，有不透明环，菌落形态单一。样品21-U887在PALCAM平板上也出现少量圆形、灰绿色菌落，有棕黑色水解圈;在李斯特氏菌显色平板上为蓝色菌落，有不透明环，但很少，只集中在划线起始位置。与阳性对照菌落形态相比，样品21-T031和样品21-U887均为可疑单核细胞增生李斯特氏菌，选择性分离平板上的菌落形态见表1。

2.2 初筛及生化实验

分别从编号21-T031和编号21-U887的选择性分离平板上挑取5个可疑单菌落接种于木糖、鼠李糖发酵管，结果显示，21-T031为木糖阴性、鼠李糖阳性;21-U887为木糖阳性、鼠李糖阴性。样品21-T031和样品21-U887表现出不一样的反应结果。采用海博单增李斯特氏菌成套生化鉴定管对样品21-T031和样品21-U887进行完整的生化鉴定，鉴定结果显示二者在木糖、鼠李糖、溶血试验和协同溶血试验cAMP中均有明显的不同，与阳性对照菌相比，样品21-T031的反应结果与单核细胞增生李斯特氏菌一致，样品21-U887的反应结果与伊氏李斯特氏菌一致，生化鉴定结果见表2。

2.3 全自动微生物鉴定及药敏分析系统鉴定结果

在使用海博单增李斯特氏菌成套生化鉴定管对样品21-T031和樣品21-U887进行生化鉴定的同时，以MicroScan WalkAway 40 Plus全自动微生物鉴定及药敏分析系统进行辅助鉴定。报告结果显示，样品21-T031为单核细胞增生李斯特氏菌，概率96.02%，而样品21-U887无准确的鉴定结果，同时鉴定标准菌株，单核细胞增生李斯特氏菌鉴定结果准确，概率98.08%，而伊氏李斯特氏菌也无法准确鉴定，可能与设备数据库菌种类别覆盖不全面有关。鉴定结果见表3。

3 结论与讨论

本次乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌的能力验证按照GB 4789.30—2016检验方法，鉴定结果发现样品21-T031和样品21-U887中菌种单一，无其他李斯特氏菌干扰，且样品21-U887中添加菌种较少，在选择性LB2增菌培养后与空白对照相比，无明显区别，在PALCAM平板和李斯特显色平板上分布极少，甚至出现空平板现象。因此，在实际检测中需要多制备几个平行，同时做阳性对照、阴性对照和空白对照。经生化鉴定，编号为21-T031检出为单核细胞增生李斯特氏菌，编号21-U887的样品未检出单核细胞增生李斯特氏菌，经鉴定为伊氏李斯特氏菌。

此外，本试验虽取得了满意的反馈结果，但也存在耗时长，MicroScan WalkAway 40 Plus全自动生化鉴定仪数据库覆盖不全面等缺点。随着检验技术的发展，分子生物学、色谱等技术不断应用到李斯特氏菌检验中。陈学强等[6]利用BAX system Q7全自动病原微生物检测系统、VITEK 2 COMPACT全自动细菌鉴定系统、基质辅助激光解析电离飞行时間质谱（MALDI-TOF-MS）和溶血素O基因（hlyA）序列比对分析、鉴定食品中单核细胞增生李斯特氏菌并取得了明显效果。因此，可根据实验室的需要，在食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验中同时辅以两种以上的检验方法，互相辅助，以提升检验效率和结果的准确性。

通过本次能力验证，本实验室的单核细胞增生李斯特氏菌的检测能力得到了验证。能力验证作为一种监督手段，有利于实验室综合能力的全面提升，也见证了中心食品检验检测实验室技术水平逐渐成熟，可更好地为榆林市人们的食品安全服务。

参考文献

[1]ORSI R H，WIEDMANN M.Characteristics and distribution of Listeria spp.，including Listeria species newly described since 2009[J].Appl Microbiol Biotechnol，2016，100（12）：5273-5287.

[2]GUILLET C，JOIN-LAMBERT O，LE MONNIER A，et al.Human listeriosis caused by Listeria ivanovii[J].Emerging Infectious Diseases，2010，16（1）：136-138.

[3]朱静鸿，龚云伟，武艳力.食品中单核细胞增生李斯特菌污染状况调查[J].中国卫生工程学，2016，15（5）：491-493.

[4]王福.单核细胞增生李斯特菌研究进展[J].口岸卫生控制，2011，16（5）：50-53.

[5]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[6]陈学强，刘阳，马炳存，等.食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证[J].食品安全质量检测学报，2018，9（19）：5080-5084.

作者简介：樊惠华（1984—），女，陕西榆林人，硕士，工程师。研究方向：食品微生物学检验。