Cd2+和Pb2+对花翅摇蚊(Chironomus kiiensis)幼虫生长发育的影响及富集效应

许力山,王剑南,哈斯巴根,孙丽丽,曹传旺,*

1 东北林业大学林学院, 哈尔滨 150040

2 呼伦贝尔市林业和草原局,林木病虫害防治检疫站, 呼伦贝尔 021008

电力工业的发展和工业废水的排放导致重金属污染随地表径流进入海洋和河流等水环境,为水生生物的生存与人类社会的经济和生态效益造成诸多隐患[1],检测重金属胁迫对水环境生态毒理效应的理论价值和经济意义日益突出。以水生生物作为受试对象,研究重金属对水生生物生理指标与生物标志物的影响可以弥补理化检测的不足[2—3]。暴露于重金属环境的水生生物在分子、组织、器官和生物体水平上受到不同程度影响,导致种群数量下降。摇蚊是水生昆虫群落中的重要组成部分,可以促进水生生态系统的碳循环。摇蚊幼虫对周围水体环境变化敏感,外源环境污染使口器和触角出现形态变化并影响其生理指标,可作为监测水质和水生态毒理实验的指示生物[4—6]。

重金属可影响摇蚊幼虫蛋白结构,降低血淋巴中贮能物质,破坏细胞和组织结构完整性,抑制免疫反应,引起氧化还原平衡失调[7]。研究报道Cd2+和Pb2+胁迫导致冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)卵活力、幼虫和蛹存活率、羽化率和成虫繁殖率显著低于对照组[8]。混合重金属离子(Cu2+、Zn2+、Cd2+、Al2+)对羽状摇蚊(Chironomusplumosus)幼虫的联合毒性在低浓度胁迫下为协同作用,高浓度为拮抗作用[9]。许多研究证实摇蚊对重金属的抗性与龄期有关[10—11],且重金属对摇蚊的影响可从亲代传递到子代[12]。Bervoets等发现游离重金属离子活性、外界pH值以及幼虫对外源pH适应性影响羽状摇蚊幼虫对重金属离子的富集[13]。水生生态系统中不同含量重金属影响摇蚊幼虫口器的致畸效应[14]。李浩等研究表明摇蚊口器致畸率与Cu2+胁迫浓度存在密切联系[15]。陈菲发现Hg2+和Cd2+诱发的口器致畸程度与重金属浓度呈极显著正相关[16]。因此,摇蚊幼虫对水环境中重金属胁迫响应可作为水质检测的指标之一,但实际水生生态系统中重金属离子的种类与含量动态变化十分复杂[17],对多种比例混合重金属离子连续共同作用下水生生物生态毒理研究甚少。

本文以我国南方地区优势种花翅摇蚊(Chironomuskiiensis)为对象,系统研究了3种配比Cd2+和Pb2+对摇蚊幼虫生长发育的影响,以及口器致畸与富集效应,初步探讨了多元重金属对摇蚊的损伤和抑制作用,为探究水环境重金属毒理机制和风险评估提供理论依据,并为水体污染早期预警提供更全面的监测指标。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫与沉积物制备

花翅摇蚊(Chironomuskiiensis)初始种群来源于中国农业大学昆虫生理与毒理实验室,用曝晒除氯5 d以上的自来水(pH 7.58,溶解氧6.02 mg/L,总硬度80 mg/L,水温(25±1)℃)饲养于玻璃鱼缸中,自然光照,使用氧气泵供氧,每7 d换水一次,每次换水投喂5—10 g金鱼饲料(北京三友创美饲料科技有限公司)。

实验过程中的沉积物根据化学品-沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于沉积物法制备[18],模拟外界环境。沉积物配比如下:4%—5%粉末状泥炭(粒度≤1 mm,pH 5.5—6.0)；20%高岭粘土(干重,高岭石含量>30%)；75%—76%石英砂(以细沙为主,50%以上50—200 μM石英砂颗粒)；加入去离子水,最终混合物的水分含量为30%—50%；加入CaCO3,将最终混合物的pH调至7.0—7.5。

1.2 Cd2+和Pb2+的致毒处理

单一重金属离子处理参照《GB 8978—1996污水综合排放标准》和《GB 3838—2002地面水质量标准》[19—20]设置胁迫浓度,CdCl2(天津市光复科技发展有限公司)浓度为0.2 mg/L,Pb(NO3)2(天津市巴斯夫化工有限公司)浓度为1.028 mg/L。混合离子按照单一毒力48 h LC50为基准[21],以Cd2+∶Pb2+等比毒性比1∶1、1∶2、2∶1配比,通过预实验确定3种混合离子配比处理组中各组分浓度值(表1),设置蒸馏水为对照。分别处理健康、活泼、大小一致的花翅摇蚊2龄幼虫。

表1 3种混合离子配比处理组中各组分浓度值

1.3 Cd2+和Pb2+对花翅摇蚊生长发育指标与口器致畸测定

将健康、活泼、大小一致的30头花翅摇蚊2龄幼虫放入盛有1 L重金属药液的鱼缸中,试验过程中不更换新溶液。不同处理组重金属浓度参照1.2。每个浓度设置5个重复,随机选取3个重复用于观察幼虫化蛹率,剩余2个重复在处理7 d和14 d时从发育至4龄的幼虫中随机取样,用于口器致畸观察。

参考黄建方法配制阿拉伯胶[22]。将48 g阿拉伯树脂溶于120 mL的蒸馏水中,完全溶解后(可放置1 d),依次加入80 g三氯乙醛,20 mL冰醋酸,20 mL 50%葡萄糖浆慢慢加热至完全溶解,待清澈透明后用滤纸过滤,置于阴暗处备用。观察前将受试花翅摇蚊幼虫用沸水烫死,使用浓度分别为20%、40%、60%、80%的乙醇分别浸泡虫体1 h,逐级脱水后,放入KOH溶液中洗涤4 h,在解剖显微镜(MOTIC,SMZ- 140)下将幼虫头部与身体剥离,保持下唇板一侧向上的形态移入滴有阿拉伯胶的载玻片上,从树胶的一侧盖上盖玻片,用适当的力度压片使幼虫口器的上颚与下唇板清晰呈现后,放在显微镜(Olympus dp71)下进行观察并对口器切片标本进行拍照。

1.4 Cd2+和Pb2+富集含量测定

将健康、活泼、大小一致的花翅摇蚊2龄幼虫放入盛有1 L重金属药液及沉积物的鱼缸中,不同处理组重金属浓度参照1.2。每个浓度3个重复,每个处理组50头,连续进行14 d,在处理7 d和14 d后每组随机选取30头摇蚊幼虫,置于去离子水中静置24 h用于清洗。于30 ℃烘箱中烘干24 h,加入6 mL HNO3、2 mL HCl和2 mL H2O2处理样本,然后置于125 ℃烘箱中消解2 h,去离子水将消解溶液定容至40 mL,用0.45 μm硝酸纤维素滤膜过滤样品,并用HNO3酸化,电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)分析重金属含量。将沉积物样品在105 ℃干燥24 h,然后用以上相同的方法进行消解,去离子水将消解溶液定容至100 mL,用相同的方法处理并测定。

生物-沉积物富集因子(BSAF)可用于评价生物对被测重金属富集的难易程度[23]。BSAF按如下公式计算:B=Ct/Cs；其中,B:生物-沉积物富集因子；Ct:摇蚊体内重金属含量,mg/kg；Cs:沉积物中重金属含量,mg/kg。

1.5 数据处理与分析

采用EXCEL软件进行数据处理和绘图。利用SPSS 20.0(SPSS Inc.,USA)统计学软件对组间各指标进行ANOVA分析,采用Duncan方法分析组间显著性差异(P<0.05)。参考中国科学院数学研究所统计组(1979)方法进行重金属交互作用计算[24]。

2 结果与分析

2.1 Cd2+和Pb2+对摇蚊幼虫化蛹率和羽化率的影响

室内重金属处理下,花翅摇蚊2龄幼虫于第9天开始化蛹,处理至第14天,对照组化蛹率最高,为27.78%。单一重金属离子处理下,Cd2+处理组的化蛹率为25.56%,高于Pb2+的化蛹率22.22%。Cd2+和Pb2+混合离子处理组1∶1、1∶2、2∶1配比化蛹率分别为13.33%、11.11%和11.11%,3种配比之间无显著性差异,但均显著低于单一重金属离子处理组,其中1∶2和2∶1配比的混合离子化蛹率最低,为对照组的39.99%(图1和表2)。

图1 Cd2+和Pb2+对花翅摇蚊幼虫化蛹率的影响

表2 Cd2+和Pb2+胁迫下花翅摇蚊幼虫化蛹率的差异显著性

对照组和单一重金属离子处理组的摇蚊幼虫第10天开始羽化,而混合离子处理组羽化时间比对照组推迟1—2 d。处理14 d,对照组羽化率为15.56%,单一重金属离子Cd2+胁迫下羽化率为11.11%,高于Pb2+羽化率8.89%。混合离子处理组1∶1、1∶2、2∶1配比羽化率分别为5.56%、4.44%、4.44%,3种配比之间无显著差异,但均低于单一重金属离子处理组,其中1∶2和2∶1配比混合离子处理组羽化率最低,为对照组的28.53%(图2和表3)。

表3 Cd2+和Pb2+胁迫下花翅摇蚊幼虫羽化率的差异显著性

图2 Cd2+和Pb2+对花翅摇蚊幼虫羽化率的影响

3种不同配比的混合离子处理后,Cd2+和Pb2+在摇蚊幼虫体内表现出交互作用,对化蛹率和羽化率产生不同程度的影响。1∶1配比的Cd2+和Pb2+对摇蚊化蛹率的交互作用依次为Cd2+和Pb2+单独作用下化蛹率的26.10%和30.02%；1∶2或2∶1配比的交互作用均为Cd2+单独作用的34.78%和Pb2+单独作用的40.01%,交互作用大。而1∶1配比的Cd2+和Pb2+对摇蚊羽化率的交互作用为负值,1∶2或2∶1配比对摇蚊羽化率的交互作用均为0,交互作用极小(表4)。

表4 Cd2+和Pb2+联合处理对花翅摇蚊幼虫化蛹率和羽化率的交互作用

2.2 Cd2+和Pb2+处理下摇蚊口器致畸效应

单一和混合重金属Cd2+和Pb2+离子诱导摇蚊幼虫口器出现不同程度和类型的致畸情况。自然条件饲养的摇蚊4龄幼虫正常口器,上颚完整且下唇板呈规则弧形。暴露于重金属离子后,其上颚和下唇板出现不同类型的畸变,主要类型为上颚前齿断裂,中齿和基齿磨损、缺失(图3)；下唇板齿部不规则,中央齿断裂、磨损,边缘齿增生、缺失等(图4)。

图3 暴露于Cd2+和Pb2+下的花翅摇蚊口器的上颚形态异常(100X)

图4 暴露于Cd2+和 Pb2+下的花翅摇蚊幼虫的下唇板致畸类型(200X)

两种重金属及其混合离子对花翅摇蚊幼虫口器致畸率如图5所示。单一重金属离子Cd2+作用7 d和14 d致畸率分别为22.42%和32.42%,低于Pb2+处理组致畸率28.62%和34.24%。在不同比例的混合离子处理组中,1∶2配比在7 d与14 d的致畸率分别为36.57%和40.61%,高于两种单一重金属离子,而1∶1配比 7 d与14 d的致畸率分别为14.95%和26.06%,2∶1配比的致畸率分别为13.33%和23.33%,二者在两个时间点均低于两种单一重金属离子。暴露于Cd2+和Pb2+环境中的花翅摇蚊致畸率显著高于对照,且致畸率随时间增长而上升,其中单一重金属Cd2+处理、混合离子1∶1配比和2∶1配比的14 d致畸率相比7 d显著升高(P<0.05)。

图5 Cd2+和Pb2+胁迫下的花翅摇蚊幼虫口器致畸率

2.3 花翅摇蚊与沉积物对Cd2+和Pb2+的富集

单一重金属Cd2+和Pb2+以及混合离子处理下花翅摇蚊体内的富集含量如图6所示。两种单一重金属处理7 d时摇蚊Cd2+和Pb2+富集含量为11.28 mg/kg和11.46 mg/kg,处理14 d时Cd2+富集含量与7 d无显著差异(11.50 mg/kg),而Pb2+富集含量显著上升(31.32 mg/kg)。不同配比Cd2+和Pb2+混合离子处理7 d时,1∶1、2∶1配比处理下摇蚊体内Cd2+的富集含量分别为14.32 mg/kg和14.20 mg/kg,显著高于1∶2配比的含量5.85 mg/kg,且这两种配比的Cd2+富集含量高于Cd2+独立作用。处理14 d 混合离子1∶1配比中Cd2+含量为15.12 mg/kg,与7 d无显著差异,2∶1配比中Cd2+富集含量为9.52 mg/kg,呈显著下降趋势；1∶2配比中Cd2+富集含量为20.99 mg/kg,呈显著上升趋势。不同配比混合离子处理下Pb2+富集含量由7 d至14 d均呈上升趋势,1∶1配比中Pb2+富集含量由7.74 mg/kg上升至16.47 mg/kg,2∶1配比中Pb2+含量9.06 mg/kg上升至12.88 mg/kg,1∶2配比中Pb2+含量15.48 mg/kg上升至42.50 mg/kg,其中1∶2配比的富集含量在两个时间点均显著高于另外两种配比(P<0.05),且高于Pb2+独立作用。

图6 花翅摇蚊幼虫体内Cd2+和 Pb2+的富集含量

单一重金属Cd2+和Pb2+及混合离子的胁迫下,沉积物的富集含量如图7所示。两种单一重金属离子暴露7 d时,Pb2+处理组富集含量为8.31 mg/kg,显著高于Cd2+富集含量1.30 mg/kg,为Cd2+处理组含量的6.38倍；暴露14 d Pb2+和Cd2+的富集含量分别为7.78 mg/kg和1.62 mg/kg,但与7 d相比无显著性差异。不同配比的Cd2+和Pb2+混合离子处理7 d,1∶1、1∶2、2∶1配比处理的沉积物中Cd2+富集含量分别为0.96 mg/kg、1.95 mg/kg和0.73 mg/kg；3种配比Pb2+富集含量分别为8.13 mg/kg、6.94 mg/kg、12.59 mg/kg,2∶1配比处理的沉积物富集含量显著高于其它配比。处理14 d,3种配比中Cd2+富集含量分别为0.89 mg/kg、0.66 mg/kg、0.69 mg/kg,无显著性差异；3种配比中Pb2+浓度分别为7.18 mg/kg、6.19 mg/kg、11.25 mg/kg,3种配比相比7 d均呈下降趋势,且差异不显著。

图7 沉积物中Cd2+和Pb2+的富集含量

单一重金属离子处理下,Cd2+7 d至14 d的BSAF呈下降趋势,Pb2+则呈上升趋势,且Cd2+的BSAF在7 d和14 d均显著高于Pb2+(表5)。不同配比混合离子处理下,1∶2配比处理7 d Cd2+的BSAF显著低于1∶1和2∶1配比的BSAF,而处理14 d显著高于1∶1、2∶1配比。Pb2+的BSAF在3种混合离子处理组中由7 d至14 d均呈上升趋势,但幅度较小(表6)。

表5 单一重金属处理中花翅摇蚊的生物-沉积物富集因子

表6 混合离子处理中花翅摇蚊的Cd2+和Pb2+生物-沉积物富集因子

3 讨论

昆虫在过量重金属胁迫下产生应激反应,消耗大量的能量,降低对食物的营养利用,干扰昆虫体内代谢和细胞正常生理功能,导致形态结构、生长发育、繁殖能力异常[7],同时水生生物可将重金属吸附在器官表面,影响器官正常生理功能,诱发细胞和组织畸型[25]。本文研究结果表明单一重金属离子Cd2+、Pb2+及混合离子胁迫显著降低花翅摇蚊幼虫的化蛹率和羽化率,延长发育历期。单一重金属Pb2+抑制作用强于Cd2+,混合离子胁迫下的化蛹率和羽化率低于单一重金属离子,表现出更强的抑制作用,这可能与Cd2+和Pb2+对摇蚊幼虫的不同毒性作用及摇蚊幼虫在重金属胁迫下多种保护酶系的活性密切相关[21]。交互作用的大小可作为化蛹率或羽化率在联合处理下不同水平的效应变化对各单一组分依赖程度的度量依据,1∶2和2∶1混合配比下的化蛹率和羽化率相同,Cd2+和Pb2+的含量变化对两种配比的交互作用相等,而Cd2+和Pb2+对化蛹率的交互作用强于羽化率,可能与重金属离子在幼虫和蛹内富集含量差异及变态发育过程中对重金属的排泄有关[26]。重金属胁迫导致摇蚊幼虫口器上颚前齿断裂、上颚中齿与基齿缺失、下唇板断裂、磨损、增生、缺失等,这将降低摇蚊幼虫在水中的取食能力,影响营养物质的积累,间接抑制摇蚊的生理功能,进而导致化蛹率和羽化率的降低。口器致畸率与重金属的种类和配比存在密切关系,单一重金属Pb2+处理和Pb2+主导的1∶2配比处理组致畸率高于其它处理组。已有研究证实摇蚊幼虫口器致畸与多线形染色体核仁活性有密切联系,致畸率随多线形染色体核仁活性的增强而上升[27],说明Pb2+对花翅摇蚊多线形染色体核仁活性的影响可能比Cd2+更大,导致致畸率更高。

重金属具有隐蔽性、长期性和不可逆性,昆虫通过摄食和呼吸等积累营养物质和维持生理平衡,食物与环境中的重金属也会在昆虫体内富集。研究报道甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)取食添加Pb2+的饲料后,在中肠检测到大量Pb2+[26],Pb2+胁迫处理下的摇蚊幼虫也出现大量Pb2+富集[28]。本文研究结果显示Cd2+和Pb2+处理7 d时摇蚊的富集含量无显著差异,处理14 d的Cd2+浓度与7 d无显著变化,而Pb2+浓度则显著升高,这种差异可能是花翅摇蚊幼虫对Pb2+的摄入与代谢的调节和控制作用不强的结果。摇蚊幼虫具有调节体内必需金属元素(如Co、Mn、Cu和Zn)的能力,将富集含量保持在稳定水平,而缺乏对Pb等非必需金属元素调节能力[29]。Pb2+主要作用于生物体系统和器官,干扰蛋白质和酶与氨基酸的结合[30],而Cd2+影响昆虫血淋巴的氧化还原平衡,破坏细胞和组织,降低昆虫免疫反应[31],且Pb2+对花翅摇蚊发挥毒力效果所需时间比Cd2+长[21],作用机制和作用时间的不同以及混合体系中一种组分对其他组分代谢酶的抑制和诱导作用[32]是混合离子不同配比在不同时间产生协同和拮抗等联合作用的重要原因,也导致了本研究中不同比例混合离子处理的Cd2+和Pb2+富集含量与单一重金属离子处理这一不同结果。1∶1和2∶1配比处理7 d时Cd2+占主导,而1∶2配比中Pb2+占主导,结果表明Cd2+主导下的致畸率低于Pb2+主导下的致畸率,而14 d时Pb2+富集含量的增加对致畸率无显著影响,可能是混合离子相互作用对各组分产生了促进或抑制的效果。

沉积物中重金属离子向水体扩散的主要因素包括水文物理干扰、底栖生物活动干扰以及盐度、溶解氧浓度等在内的化学环境条件[33—34]。梁霞等证实沉积物中Pb2+释放的主要影响因素为水-沉积物界面pH值及物理干扰,在pH≥7.0的条件下,沉积物中重金属释放量相对较低[28]。本研究中水体-沉积物界面的pH值稳定在7.0—7.5,说明重金属Pb2+主要通过摄食和体表渗透进入摇蚊的消化系统和循环系统形成富集效应。重金属的生物-沉积物富集因子(BSAF)与生物对重金属的富集能力呈正相关,Cd2+在不同处理组7 d至14 d的BSAF均高于Pb2+,表明花翅摇蚊对Cd2+的富集能力比Pb2+更强,这一结果与刘晓伟等人的研究结果一致[23]。此外,混合离子处理下14 d沉积物中Cd2+和Pb2+富集含量比7 d低,这可能与摇蚊幼虫的吸收和摄食转化等因素有关[7]。混合离子处理7 d的1∶2处理组以及处理14 d的3种配比处理组中Pb2+富集含量高于Cd2+含量,但富集能力低于Cd2+,这可能与摇蚊对Pb2+和Cd2+的摄入与代谢的调控能力以及富集阈值不同有关,Cd2+富集含量达到富集阈值后受到体内调控作用不再增加,Pb2+调控作用不强导致Pb2+富集含量未达到富集阈值时不断增加,而Pb2+富集阈值往往取决于环境浓度[29]。重金属胁迫延长摇蚊幼虫的发育历期,将影响单位时间内摇蚊的世代数和种群数量,破坏水环境的生态循环[35],而摇蚊作为水环境食物链的底层,其生物量的变化和体内重金属的富集也将影响整个水生生态系统乃至人类健康。本研究结果可为水生生态系统中复杂组分之间的相互作用提供理论支持,并为研究混合重金属离子对水生生物各生理指标的影响以及完善重金属生物监测提供理论参考。