黄芪甲苷对局灶性脑缺血后适应中Wnt/β-catenin信号通路关键因子表达的影响*

徐玥玮， 王丽， 高晓明， 谢若男， 王雷， 杨满琴**

(1.安徽中医药大学第二附属医院 药学部， 安徽 合肥 230061； 2.安徽中医药大学 药学院， 安徽 合肥 230061)

缺血性卒中是中枢神经系统的常见血管疾病，是全球致残和死亡的主要原因。血管再通可以补充血管中的营养物质和氧气，并去除有毒代谢物，是缺血性卒中的主要的治疗方法[1]。然而，缺血再灌注损伤能激活坏死、凋亡、自噬等一系列细胞死亡程序，常导致严重的神经功能障碍[2]。因此，寻找有效的缓解缺血再灌注损伤的方法是临床上急需解决的问题。缺血后适应即在长期严重的脑缺血后，在再灌注开始前应用反复短暂性灌注的方法被证明可缓解脑缺血再灌注后造成的损伤[3]。Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)是高度保守的信号通路，广泛存在于多细胞真核生物中，并与细胞多种生理和病理过程密切相关[4]。有研究表明，Wnt/β-catenin在脑、肾、肝脏等器官的缺血再灌注损伤中起保护作用[5]。同时Wnt蛋白广泛存在于脑血管和血脑屏障中，参与脑血管的形成和血脑屏障分化，在血脑屏障的形成和维持、脑血管的再生和重塑中也起到重要的作用[6]。有研究表明，脑损伤时，多种药物通过介导Wnt/β-catenin信号通路诱导神经保护、促进神经发生，进而减轻脑血脑再灌注损伤[5，7-8]。但目前Wnt/β-catenin对脑缺血后适应的调节作用尚不清楚。黄芪甲苷是从中药黄芪中提取的最有生物活性的单体，研究表明黄芪甲苷具有很强的神经保护作用[9]，黄芪甲苷可通过减弱氧化应激损伤、抑制细胞凋亡、促进血管重构和再生等途径对多器官的缺血再灌注损伤起保护作用[10]。 研究发现，黄芪甲苷可激活Wnt/β-catenin信号通路促进卒中小鼠的神经发生并减轻认知障碍[11]，本研究旨在探讨黄芪甲苷通过调节Wnt/β-catenin对脑缺血后适应的影响及其作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

黄芪甲苷购自阿拉丁公司，尼莫地平购自美仑生物，大鼠源高敏c反应蛋白(high-sensitivity C-Reactive Protein，hs-CRP)ELISA试剂盒购买自Elabscience公司，大鼠源S100钙结合蛋白B(S100 calcium binding protein B，S100-B)ELISA试剂盒购自优尔生公司，PCR相关试剂均购自BioTeke公司，Wnt家族成员3A(Wnt3a)、β-catenin、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和磷酸化β-catenin(p-β-catenin)抗体购自万类生物，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1实验动物及分组 SPF级SD雄性大鼠，6～8周龄，体质量260～320 g。适应性喂养1周后，随机分为7组：假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注组(I/R组)、缺血后适应组(IPC组)、中药单体黄芪甲苷(低，10 mg/kg)+缺血后适应组(IPC+AS-IV10组)、中药单体黄芪甲苷(中，20 mg/kg)+缺血后适应组(IPC+AS-IV20组)、中药单体黄芪甲苷(高，50 mg/kg )+缺血后适应组(IPC+AS-IV50组)、尼莫地平+缺血后适应组(IPC+Nim组)，每组12只大鼠。Sham组仅暴露颈总动脉，不进行线栓阻断及缺血-再灌注处理。I/R组建模方式参照文献[12]的方法，具体步骤如下：大鼠予10%水合氯醛腹(4 mL/kg)腔注射，麻醉后仰卧固定，颈部正中切口约4 cm，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉；动脉夹夹闭右侧颈总动脉，在靠近颈内外动脉分叉处的颈外动脉斜形切口，将带有圆形尖端的4-0单丝尼龙缝线通过颈外动脉残端插入颈内动脉，并轻轻推进以阻塞大脑中动脉内，使其闭塞2 h后(缺血)，拆除缝线恢复血流(复流)；IPC组在大脑中动脉闭塞2 h后，复流30 s后再缺血30 s，完成“复流30 s—缺血30 s”3个循环，然后拆除缝线恢复血流；IPC+AS-IV10、IPC+AS-IV20、IPC+AS-IV50组在造模前分别按10、20、50 mg/kg剂量给予黄芪甲苷连续灌胃7 d，于末次灌胃后2 h进行IPC手术；IPC+Nim组在IPC术前给予尼莫地平(10 mg/kg)连续口服15 d，于末次灌胃后2 h进行IPC手术。

1.2.2神经功能评估 手术24 h后，对大鼠进行神经功能学评估[13]，没有神经损伤体征计0分，不能完全伸直对侧前爪计1分，身体向偏瘫侧转圈计2分，身体向对侧倾倒计3分，不能自发行走、意识丧失计4分。

1.2.3计算脑梗死面积 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TCC)染色检测脑梗死面积。所有大鼠神经功能学评估完成后处死并取出脑组织，在-20 ℃冰箱冷冻1～2 h，去除嗅球、小脑后将大脑冠状面平均切分为5片，将脑片后放入1 %TTC溶液中，37 ℃染色10～15 min，期间注意避光并不断的翻动切片使之染色均匀，染色结束后摆齐，拍照并软件计算梗死区面积。

1.2.4脑组织学观察 大鼠脑组织4 %多聚甲醛固定后，石蜡包埋后切成5 μm薄片、行HE染色[14]，显微镜下观察并拍照。

1.2.5血清hs-CRP、S100-B水平检测 ELISA试剂盒检测各组大鼠血清hs-CRP、S100-B(脑组织损伤标记物)水平，分别按照hs-CRP、S100-B商品化试剂盒说明术操作步骤处理血清，通过酶标仪测定450 nm的OD值，以OD值为横坐标，标准品浓度为纵坐标，根据标准曲线计算出各样本浓度。

1.2.6脑组织中Wnt3a、β-catenin、BDNFmRNA检测 实时荧光定量聚合酶链式反应检测脑组织中Wnt3a、β-catenin、BDNFmRNA表达。使用TRIpure RNA试剂提取脑组织的总RNA，并通过紫外分光光度计NANO 2000测定RNA浓度，然后用Super M-MLV 反转录酶将RNA反转录成cDNA，通过ExicyclerTM 96荧光定量仪进行荧光定量分析，按2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequencing information

1.2.7脑组织中Wnt3a、β-catenin、BDNF和p-β-catenin的蛋白检测 免疫印迹检测Wnt3a、β-catenin、BDNF和p-β-catenin蛋白表达。取适量大鼠脑组织，使用全蛋白提取试剂盒抽提细胞蛋白并用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，取蛋白样品进行丙烯酰胺凝胶电泳并转印至聚偏二氟乙烯膜，将Wnt3a(1 ∶500)、β-catenin(1 ∶400)、BDNF(1 ∶1 000)和p-β-catenin(1 ∶1 000)相应一抗分别放入封闭液中，4 ℃孵育过夜，之后分别加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶5 000)，37 ℃孵育45 min，最后用ECL化学发光试剂使底物发光。用凝胶图象处理系统分析目标条带的光密度值，以β-actin做内参。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠神经功能评分

Sham组大鼠神经功能学评分为0分，未见神经功能损伤的症状。与Sham组相比，I/R组大鼠复流24 h后神经功能损伤评分上升(P<0.05)；与I/R组相比，IPC组、IPC+AS-IV10组、IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组大鼠神经功能学评分降低(P<0.05)；与IPC组相比，IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组大鼠神经功能学评分降低(P<0.05)。见图1。

2.2 大鼠脑梗死面积

Sham组脑组织没有白色梗死组织，I/R组可见明显白色梗死组织(P<0.05)。与I/R组比较，IPC组、IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组白色梗死组织减少(P<0.05)；与IPC组比较，IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组白色梗死组织减少(P<0.05)；但IPC+Nim组与IPC+AS-IV50组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.3 大鼠脑组织学观察

Sham组大鼠脑组织形态正常，染色均一；I/R组大鼠脑组织细胞明显减少，无法分清各层，大部分神经元出现变性、坏死，大量神经元细胞出现核固缩，部分核仁消失，胞体变形，出现严重空泡样变。IPC组、IPC+AS-IV10组、IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组出现异形、核固缩的细胞数量不同程度的减少，及轻微细胞水肿。IPC+Nim组正常细胞数量较I/R组明显增多，仅有少量的空泡样变。见图3。

2.4 大鼠血清S-100B、hs-CRP含量

I/R组大鼠血清中S-100B、hs-CRP含量明显高于Sham组(P<0.05)；与I/R组比较，IPC组、IPC+AS-IV10组、IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组血清中S-100B、hs-CRP含量降低(P<0.05)；与IPC组比较，IPC+AS-IV10组、IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组血清中S-100B、hs-CRP含量降低(P<0.05)。见图4。

2.5 大鼠脑组织Wnt3a、β-catenin以及BDNF mRNA表达

与Sham组相比，I/R组大鼠脑组织中Wnt3a、β-catenin以及BDNFmRNA水平降低(P<0.05)。与I/R组比较，IPC组、IPC+AS-IV10组、IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组以及IPC+Nim组大鼠脑组织中Wnt3a、β-catenin以及BDNFmRNA水平升高(P<0.05)。与IPC组比较，IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组大鼠脑组织中BDNF、Wnt3amRNA升高(P<0.05)，IPC+AS-IV10组、IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组大鼠脑组织中β-cateninmRNA升高(P<0.05)。此外，大鼠脑组织中Wnt3a、β-cateninmRNA的表达呈现黄芪甲苷剂量依赖；与IPC+AS-IV20组比较，IPC+AS-IV50组Wnt3amRNA的表达升高(P<0.05)；IPC+AS-IV10组、IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组间比较，β-cateninmRNA的表达随剂量增高而升高(P<0.05)。见图5。

2.6 大鼠脑组织Wnt3a，β-catenin以及BDNF蛋白的表达

与Sham组相比，I/R组大鼠脑组织中Wnt3a，β-catenin和BDNF蛋白的表达均降低(P<0.05)；与I/R组比较，IPC组、IPC+AS-IV10组、IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组的Wnt3a、β-catenin和BDNF蛋白水平升高(P<0.05)。与IPC组比较，IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组Wnt3a蛋白水平增高，且IPC+AS-IV50组的Wnt3a蛋白水平高于IPC+AS-IV20组(P<0.05)；与IPC组比较，IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组β-catenin蛋白水平增高(P<0.05)，且IPC+AS-IV50组的β-catenin蛋白水平高于IPC+AS-IV10组(P<0.05)；与IPC组比较，IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组BDNF蛋白水平增高，且IPC+AS-IV50组的BDNF蛋白水平高于IPC+AS-IV10组(P<0.05)。与Sham组相比，I/R组大鼠脑组织中p-β-catenin蛋白表达升高(P<0.05)；与I/R组比较，IPC组、IPC+AS-IV10组、IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组的p-β-catenin蛋白水平下降(P<0.05)；与PIC组比较，IPC+AS-IV20组、IPC+AS-IV50组、IPC+Nim组的p-β-catenin蛋白水平下降(P<0.05)，且IPC+AS-IV20组p-β-catenin蛋白水平高于IPC+AS-IV50组(P<0.05)。见图6。

3 讨论

近年来，缺血性卒中的治疗方法不断发展，但及时溶栓处理恢复血管血氧供应一直是治疗缺血损伤的标准方法。然而血管再通后，随之而来的是血小板过度活化、微血管损伤、氧化应激、细胞内钙超载以及过度炎症反应，因而对受损的脑组织造成第二次损伤即缺血再灌注损伤。在临床治疗上，缺血再灌注损伤的程度与患者的死亡率和致残率密切相关。因此全面了解缺血再灌注损伤、抑制或减轻缺血再灌注损伤对提高再灌注治疗的有效性有关键作用[15]。缺血后适应是恢复冠状动脉血流灌注前给予反复几次短暂灌注可明显减轻再灌注损伤，并有研究表明，与缺血再灌注相比，缺血后适应对局灶性脑损伤具有一定的神经保护效应[16]。

中药单体黄芪甲苷是中药黄芪中的有效成分，现代药理研究表明，黄芪甲苷对多种缺血再灌注、心血管疾病、肺部疾病、肝纤维化和糖尿病肾病等均有保护作用[17-18]。近年来，已有多项研究表明，黄芪甲苷对脑缺血再灌注损伤有保护作用[19]。本研究中，采用大鼠I/R模型，在大鼠脑缺血后给予缺血后适应处理，结果表明，再灌注前进行缺血后适应处理有效的减少了大鼠脑梗死面积，并降低了大鼠神经功能学评分，表现出神经保护效应。本研究探讨中药单体黄芪甲苷联合缺血后适应对大鼠I/R损伤的神经保护作用，给予IPC大鼠不同剂量的黄芪甲苷后，大鼠脑梗面积和神经功能损伤程度明显减少。但是黄芪甲苷联合缺血后适应的治疗在脑缺血再灌注损伤中神经保护作用及其分子机制尚不清楚。

研究表明，黄芪甲苷可以通过Wnt/β-catenin信号刺激细胞成骨分化，揭示出黄芪甲苷对Wnt/β-catenin通路的调控作用[20]。但是黄芪甲苷联合缺血后适应处理缓解I/R损伤的神经保护作用是否通过Wnt/β-catenin通路尚不明确。Wnt是参与胚胎和肿瘤发生的关键信号，并维持成年期的神经元稳态。Wnt/β-catenin是Wnt通路中经典的信号通路，是神经元发育和维持稳态的重要的信号通路，在Wnt缺失的情况下，细胞质内的GSK-3β与Axin和APC等以复合物的形式p-β-catenin并使其降解，Wnt通路关闭。当Wnt配体蛋白与细胞表面受体FZD、卷曲蛋白LRP5/6结合时，触发细胞内的信号转导，Wnt/β-catenin信号通路被激活，随后抑制β-catenin的磷酸化，从而促进β-catenin的稳定。稳定的β-catenin易位到细胞核内，与T细胞因子TCF相互作用，提高促细胞存活的关键因子表达[21]。脑源性神经营养因子BNDF是在神经系统中广泛表达的具有神经营养作用的蛋白质，BNDF的表达水平与认知功能呈正相关性。因此本研究采用了RT-PCR和Western Blot分别检测大鼠脑组织Wnt3a、β-catenin和BNDF mRNA及蛋白的表达，探究黄芪甲苷处理后对Wnt/β-catenin的调控作用，并以BNDF的表达反映黄芪甲苷调控Wnt/β-catenin对脑损伤的恢复功能。结果显示缺血后适应以及黄芪甲苷联合缺血后适应处理不同程度的上调了Wnt家族中重要蛋白Wnt3a及下游β-catenin的表达，并上调了BNDF的表达。

总之，本研究揭示了缺血后适应处理有助于缓解缺血再灌注造成中枢神经系统的神经元损伤；黄芪甲苷可以促进缺血后适应处理对局灶性脑损伤脑保护作用。本研究发现，黄芪甲苷联合缺血后处理可上调Wnt3a、β-catenin和BNDF的表达，这些影响可能通过Wnt3a/β-catenin信号通路调节大鼠再灌注损伤。