幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白不同片段对胃癌细胞γH2AX表达的影响*

贾岑岑， 王琴容， 周建奖， 程薇， 赵艳，**

(1.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室 & 贵州省医学分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附属医院 血液科， 贵州 贵阳 550004)

胃癌是全球范围内常见的消化道肿瘤，发病率和死亡率分别排在所有肿瘤第5位和第3位，在中国胃癌发病率居第3 位[1]。幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)在胃炎、消化性溃疡和胃癌的发病机制中起着重要作用，被认为是胃癌的致病菌，其表达的细胞毒素相关基因A (cytotoxin-associated gene A, CagA) 蛋白和空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A，VacA)是H.pylori致病的关键因素[2-3]。CagA通过细菌Ⅳ型分泌系统进入胃上皮细胞，其C端有5个氨基酸组成的基序，即谷氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸(glu-pro-lle-tyr-ala ，EPIYA)基序。宿主细胞内酪氨酸激酶使EPIYA基序中酪氨酸磷酸化，与相邻序列一起产生CagA的生物活性[4]。CagA蛋白有EPIYA-A、EPIYA-B、EPIYA-C及EPIYA-D 4种不同的EPIYA基序，从西方国家分离的菌株通常具有EPIYA-A、EPIYA-B和EPIYA-C，称西方型CagA；而东亚国家的菌株具有EPIYA-A、EPIYA-B和EPIYA-D序列，称东亚型CagA[5-6]；在亚洲国家的东方型CagA比西方型CagA引起胃癌发生的风险更高[7]。有研究显示，CagA阳性菌株的感染会增加胃黏膜的炎症，引发氧化应激和DNA损伤，从而增加宿主细胞中基因组不稳定，增强胃癌发生的风险[8-10]。DNA双链断裂(double-strand breaks，DSBs)是DNA损伤的一种特征类型，磷酸化组蛋白H2AX (histone protein H2AX，γH2AX)是由DSB断点处的组蛋白H2AX磷酸化而来，γH2AX参与DNA损伤应答过程，是目前最常用的 DSBs 损伤评价的指标，因而用特异性抗体标记γH2AX后、可通过荧光显微镜观察焦点的多少来判断DNA双链断裂的多少，从而判断DNA损伤[11-12]。本研究选取课题组前期分离的H.pylori东亚株，构建不同序列的CagA表达载体，转染细胞，分析不同序列的CagA对胃癌细胞DNA损伤的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞株及H.pylori胃癌AGS细胞株购于美国ATCC公司，H.pyloriGZ7ΔCagA(CagA敲除株)由课题组前期构建，H.pyloriGZ7(野生株)由课题组分离、鉴定和保存，其CagA序列已上传GenBank数据库 (KR154737)，鉴定为典型东亚株。

1.1.2主要试剂及仪器 无内毒素质粒小提中量试剂盒(天根生化科技有限公司)，Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)，伯克改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清及胰酶(美国Gibco公司)，兔抗 γH2AX抗体 (1 ∶200,proteintech)、荧光二抗 (1 ∶200，proteintech)及pcDNA3.1(PC)质粒(上海生物生工公司)；微需氧产气袋及密封罐(日本三菱公司)，流式细胞分析仪(美国BD Medical Technology公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 研究方法

1.2.1细菌质粒的转化及测序鉴定 本课题组前期构建并保存的各种H.pyloriGZ7-CagA表达载体分为载体a、载体b、载体c、载体d和载体e，将5种不同质粒分别置于感受态细胞DH5α中，冰上30 min，42 ℃水浴中热激90 s，置于冰上；加Luria-Bertani(LB)液体培养基500 μL，2 000 r/min于37 ℃空气震荡1 h，涂布于50 mg/L Ampicillin的LB培养板上，37 ℃培养18 h，挑取阳性单克隆菌落，于含Ampicillin的液体LB培养基中扩大培养；用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒后进行测序鉴定。见图1。

1.2.2细胞培养及质粒转染 人胃癌细胞AGS用含10 %胎牛血清和1%青霉素、链霉素的DMEM培养基，37 ℃、5%CO2恒温培养；取对数生长期的人胃癌细胞以4×105个/孔细胞量接种于6孔细胞培养板，细胞融合度至60%时，设PC组及载体a、载体b、载体c、载体d、载体e组，分别用PC质粒和载体a、b、c、d、e以质粒 ∶Lipofectamine2000为3 ∶5的比例分别转染AGS细胞，6 h后更换培养基，37 ℃、5%CO2恒温培养至48 h，收集细胞备用。

1.2.3H.pylori的培养及细胞感染H.pyloriGZ7和H.pyloriGZ7ΔCagA接种于哥伦比亚血琼脂平板并放置于密封罐中，加微需氧产气袋(7%氧气、10%CO2、83%氮)37 ℃培养3 d ；取对数期生长的胃癌细胞接种于6孔板，按感染复数(multiplicity of infection，MOI；细菌 ∶细胞) 30 ∶1加H.pyloriGZ7和H.pyloriGZ7ΔCagA感染细胞，分为Control组、H.pyloriGZ7组和H.pyloriGZ7ΔCagA组，感染6 h后换液。

1.2.4免疫荧光检测γH2AX 将对数生长期的胃癌细胞AGS接种于已放有玻片的6孔细胞培养板，分别用不同的载体转染细胞48 h，4%多聚甲醛固定细胞30 min，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline， PBS)洗涤，加0.3%Triton-X 100通透细胞30 min，PBS洗涤3次、5 min/次；5%牛血清蛋白封闭液封闭1 h；加兔抗γH2AX抗体(1 ∶200)4 ℃过夜；PBS洗涤，加羊抗兔的荧光二抗(1 ∶200)室温1 h；PBS洗涤3次、5 min/次，加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)溶液避光孵育10 min；PBS洗涤3次，滴加适量的抗荧光猝灭剂，荧光显微镜观察采图。

1.2.5流式细胞仪检测细胞周期 分别收集各种载体转染48 h后的细胞，1 000 r/min离心5 min，预冷的PBS洗涤细胞2次；加预冷的PBS制备的70%乙醇，吹打混匀，4 ℃过夜；1 000 r/min离心5 min，去除乙醇，PBS洗涤细胞1次，加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液500 (L于4℃避光孵育30 min，尼龙布过滤样本，流式细胞仪分析样本。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 载体鉴定

复苏本课题组保存的5个不同片段的CagA质粒，转化大肠杆菌，培养后提取质粒，测序验证，用Snapgene 6.0进行序列比对(图2)，提示所有的载体构建成功。

2.2 H. pylori GZ7和H. pylori GZ7ΔCagA感染对胃癌细胞DNA损伤的影响

免疫荧光结果显示，H.pyloriGZ7感染的胃癌细胞AGS核内γH2AX的表达高于H.pyloriGZ7ΔCagA感染的细胞(P<0.05 )，提示H.pylori注入细胞的CagA是引起细胞DNA损伤的主要因素。见图3。

2.3 不同序列的CagA载体转染对胃癌细胞γH2AX表达的影响

将不同序列的CagA载体转染胃癌细胞AGS，用免疫荧光检测γH2AX的表达情况。结果显示，与PC组比较，载体a、载体b、载体c、载体d和载体 e转染后胃癌细胞AGS细胞核内γH2AX的表达均有增加(P<0.05或P<0.01)，其中载体b、载体c和载体d表达增加更明显(P<0.01)，提示CagA中的EPYIA序列是引起细胞DNA损伤的主要结构。见图4。

2.4 不同序列的CagA载体对细胞周期分布的影响

不同载体转染胃癌细胞AGS后用流式细胞仪检测细胞周期，结果表明，载体 a和载体 c转染后胃癌细胞AGS的G0/G1期细胞比例升高(P<0.05)，载体 b、载体 c、载体d及载体e转染后胃癌细胞AGS的G2/M期比例明显升高(P<0.01)。见图5。

3 讨论

超过60%的胃癌是由H.pylori感染引起，被归类为I类致癌物，是导致慢性胃炎、消化性溃疡和胃腺癌等严重胃疾病中已知最强的风险因素[13]。它含有多种黏附素，介导细菌与胃上皮细胞的紧密粘附，从而启动和促进细菌Ⅳ型分泌系统的形成[14-16]。CagA通过细菌Ⅳ型分泌系统进入胃上皮细胞，其C端的EPIYA基序被宿主细胞内c-Src和c-Abl家族的酪氨酸激酶依次磷酸化，磷酸化后的酪氨酸与Src同源2磷酸酶[Src homology 2(SH2)-containing protein-tyrosine phosphatase，SHP2]或适配蛋白(growth factor receptor-bound protein 2，GrB2)相互作用，从而激活一系列相关通路，抑制细胞的增殖并阻碍细胞间的粘附[17]。

DNA损伤是DNA在复制过程中核苷酸序列发生永久性改变，从而导致遗传特征发生改变。受损的DNA复制可能导致基因突变，癌基因、抑癌基因或控制细胞周期的基因突变可以产生在增殖方面具有明显优势细胞群，这一系列改变是癌症发生发展的重要分子机制。DSBs是最严重的DNA损伤类型之一，是DNA双螺旋结构中2条互补链于同一对应处或紧密相邻处同时断裂的DNA损伤，断裂处可诱导组蛋白H2AX保守区139位丝氨酸磷酸化形成γH2AX，进而募集DNA修复蛋白完成DNA的损伤修复，是细胞发生双链DNA断裂的特征性标志。有研究报道，细胞发生DSBs后1～3 min即有γH2AX出现在DSBs处，显微镜下在细胞核中可见特征性的点状结构(foci)，10 min时达到最高，因而用来评价DSBs的程度[18]。体外研究表明，H.pylori通过诱导DSBs并抑制胃上皮细胞中多种DNA修复基因的功能，是通过调节DNA损伤修复反应而导致胃癌发生的关键因素[19-20]，但其潜在机制尚未完全清楚。H.pylori可通过多种方式引起细胞DNA损伤：(1)H.pylori持续感染引起细胞中活性氧增加，引起DNA损伤[21]；(2)H.pylori通过细菌IV型分泌系统激活NF-κB，使核苷酸内切酶XPF和XPG富集，引起DNA损伤[22]；(3)CagA已被证明可与PAR1、MARK相互作用，导致DSBs增加和染色体不稳定[23-24]；(4)H.pylori感染被报道会诱发微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)以及移码和点突变[25-29]。 然而这些研究结果主要是基于H.pylori西方株获得的。

γH2AX是细胞DNA损伤后修复的特征性标志，通常用于判断细胞DNA损伤。本研究利用课题组前期分离的CagA+H.pylori东亚株，首先证实H.pylori野生株比CagA敲除株引起γH2AX表达更高，提示CagA是引起细胞DNA双链断裂损伤的主要因素；随后构建了CagA不同区域的表达载体，5个载体转染后，所有胃癌细胞的S期细胞百分数均降低，提示不同序列的CagA载体均能抑制细胞增殖，转染胃癌细胞后发现含有完整EPYIA基序的CagA(载体b、c及d)是引起细胞DNA双链断裂损伤的重要结构，而去除EPYIA基序后，CagA(载体a和e)使细胞DNA双链断裂损伤明显降低。细胞DNA损伤后会阻断细胞周期的进程，使细胞阻滞于G0/G1期或G2/M期，让细胞进行DNA的修复反应。DSBs主要启动2种类型的修复途径——同源重组和非同源末端连接，前者主要发生于晚S期和G2期，后者则发生G1期和早S期[30]。本研究结果表明，所有的CagA载体(包括去除EPYIA基序的载体a和载体e)均能抑制细胞周期的进程，其中载体b、c、d及e可使细胞阻滞于G2/M期，载体a则使细胞主要阻滞于G0/G1。进一步提示CagA能引起细胞的DNA损伤，尤其是携带EPYIA基序的CagA主要引起DSBs并以DNA的同源修复为主，同时显示除了DSBs以外，CagA还能引起其它类型的DNA损伤。

综上，本研究结果表明CagA是H.pylori感染诱导细胞DSBs的重要因素，而CagA中的EPYIA基序是其损伤的重要结构，从而为H.pylori-CagA在胃癌发生发展中的作用提供了重要线索。