小檗碱联合阿霉素对三阴性乳腺癌MDA-MB-231/ADR细胞株增殖迁移的影响及机制*

李翀瑶, 杨宇石, 孙紫君, 黄瑾瑾, 范梦蕾, 李小虎, 薄莉, 徐澍*

(1.贵州医科大学附属医院 病理科， 贵州 贵阳 550004； 2.贵阳市第二人民医院 病理科， 贵州 贵阳 550004)

乳腺癌(breast carcinoma)是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升且趋于年轻化，严重威胁女性生命健康[1]。在中国，约15%的乳腺癌患者雌、孕激素受体、原癌基因人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)表达均为阴性，称为三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)。相对于其他分子分型，TNBC缺乏行之有效的靶向治疗，只能采取一些副作用大而治疗效果未知的放化疗，导致患者复发风险高、预后差。小檗碱(berberine, BBR)作为一种黄连根茎中提取的异喹啉类生物碱，可单独通过周期阻滞、促进凋亡等作用辅助其他药物和放疗的方法抑制乳腺癌的发生发展[2]。目前未见有关于BBR通过表观遗传修饰机制治疗乳腺癌及BBR联合阿霉素(adriamycin，ADR)治疗乳腺癌的报道，本试验通过观察BBR联合ADR对人乳腺癌MDA-MB-231/ADR细胞增殖迁移的影响，并探讨其作用机制，拟为表观遗传学治疗三阴性乳腺癌奠定试验基础。

1 材料和方法

1.1 材料仪器

人乳腺癌MDA-MB-231/ADR细胞株购自上海钰博生物科技有限公司，属于贴壁细胞，以1 ∶2～1 ∶4比例进行传代，每周需换液2～3次。PBS缓冲液购自HYCLONE，L-15培养基、北美胎牛血清购自SCIENCELL。GBICO胰酶消化液含EDTA、双抗、CCK-8检测盒、盐酸阿霉素、盐酸小檗碱，购自碧云天公司。倒置显微镜、PCR热循环仪(T100Tm Thermal Cycler，用于蛋白变性)、Bio-rad凝胶成像系统、凝胶成像仪(Universal HoodⅢ)，购自美国Bio-rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1MDA-MB-231/ADR细胞培养 用含13%胎牛血清，1%青霉素/链霉素的DMEM培养液，5%CO2，37 ℃恒温培养箱中培养，细胞传代4次后液氮冻存。

1.2.2CCK-8实验检测MDA-MB-231/ADR细胞的增殖活性 将对数生长期的MDA-MB-231/ADR细胞分为对照组、ADR组、BBR组、ADR与BBR药物联用组(药物联用组)。待细胞贴壁后分别加入ADR(终浓度0.5、1、1.5、2、2.5 mg/L)和BBR(终浓度20、40、60、80、100 μmol/L)，药物联用组80 μmol/L BBR加入以上浓度的ADR溶液中；以L-15培养基为阴性对照，每个浓度设置6个平行孔。使用酶标仪检测450 nm处吸光度，计算细胞存活率。细胞存活率=[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照组吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

1.2.3蛋白印迹实验(Western Blot)检测MDA-MB-231/ADR细胞中P300、H3K56ac、SIRT2蛋白表达水平 将对数生长期的MDA-MB-231/ADR细胞分为对照组、ADR组、BBR组以及药物联用组，等量接种于6孔板中，每孔1×105个/mL；取80 μmol/L BBR、半数抑制浓度ADR(1 mg/L)及同浓度ADR(1 mg/L)+BBR(80 μmol/L)进行干预，未加药组设为阴性对照，每组为3个复孔；24 h后PBS冲洗3次，每孔加入裂解液100 μL，冰上裂解30 min后12 000 r/min，4 ℃、20 min离心获取上清蛋白提取物；制取上样缓冲液20 μL使用PCR仪进行变性(100 ℃，10 min)；经恒压电泳、转膜、常温封闭后，摇床一抗4 ℃孵育过夜(β-actin 抗体浓度1 ∶1 000，P300抗体浓度1 ∶5 000，H3K56ac抗体浓度 1 ∶1 000，SIRT-2抗体浓度 1 ∶2 500)，二抗(1 ∶5 000)孵育1 h；滴加显影液曝光，计算各条带灰度值及其与内参灰度值的比值。

1.2.4细胞划痕实验检测MDA-MB-231/ADR细胞的迁移能力 将MDA-MB-231/ADR细胞以5×105个/mL浓度接种于6孔板，过夜后融合率达100%,用同只200 μL无菌枪头垂直于孔板划痕；PBS清洗细胞3次后对照组加入1.5 mL、2%血清培养基，ADR组、BBR组和药物联用组中依次加入终浓度为1 mg/LADR、80 μmol/LBBR及1 mg/LADR+80 μmol/LBBR的溶液各1.5mL，入培养箱24 h后观察细胞迁移情况。迁移率(%)=(原面积-闭合面积)/原面积×100%

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 MDA-MB-231/ADR细胞增殖活性

CCK-8实验结果显示，ADR对MDA-MB-231/ADR细胞增殖的抑制作用随着浓度的增加明显增大，波动于15.1%～67.87%，差异均有统计学意义(P<0.05);由此可见ADR对MDA-MB-231/ADR细胞增殖抑制作用呈浓度依赖性。BBR对MDA-MB-231/ADR细胞无增殖抑制作用，差异无统计学意义(P>0.05)。同浓度ADR联合80 μmol/L BBR对MDA-MB-231/ADR细胞存活率明显低于单独使用ADR，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)，表明BBR能够明显提高MDA-MB-231/ADR细胞对ADR的敏感性。后续实验取用整数值1.0 mg/L ADR作为ADR浓度。

2.2 MDA-MB-231/ADR细胞中P300、H3K56ac、SIRT2蛋白表达

与对照组相比，BBR组及药物联用组中P300、H3K56ac蛋白表达水平下降，SIRT2蛋白含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与BBR组相比，药物联用组SIRT2蛋白升高、H3K56ac蛋白降低更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。提示BBR增强MDA-MB-231/ADR细胞对ADR的敏感性可能与P300、SIRT2、H3K56ac蛋白有关。见图2。

2.3 通过细胞划痕实验检测MDA-MB-231/ADR细胞的迁移能力

与对照组相比，ADR组、BBR组及药物联用组的MDA-MB-231/ADR细胞迁移率变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

3 讨论

乳腺癌是一种来自乳腺终末导管小叶单元的恶性肿瘤，在全球范围内乳腺癌发病率居首位、死亡率居第五位[1]。TNBC是一种缺乏激素受体表达和HER-2基因扩增的乳腺肿瘤亚型，占新诊断乳腺肿瘤的24%[3]。TNBC因治疗缺乏靶向受体，较其他分型侵袭性强、复发转移早，治疗方案目前仍只能采取副作用大、治疗效果未知的放化疗。研究表明，采用中西药物治疗肿瘤时，有些可以产生协同甚至逆转耐药作用，提高疗效并降低毒性[4]。

BBR又称黄连素，是一种从毛茛科黄连属植物黄连根茎中提取的异喹啉类生物碱。近年来研究发现，BBR可单独通过周期阻滞、促进凋亡、抗乳腺肿瘤细胞增殖、转移以及抗炎作用，或辅助其他药物和放疗抑制乳腺癌的发生发展[5-7]。Lin等[8]对BBR治疗TNBC进行了更为全面性的研究，BBR作用后的细胞周期分析显示，468/549细胞的G0/G1比例增加,并且231/453细胞中S+G2/M比例增加，表明BBR对不同亚型的TNBC细胞有不同的抗增殖作用。Du等[9]研究发现BBR能够增强吴茱萸碱对MCF-7乳腺癌细胞的治疗敏感性，两者联合使用有诱导MCF-7细胞周期阻滞、促进凋亡的作用。还有研究已证实，BBR呈量-效及时-效关系抑制MDA-MB-231非耐药细胞增殖[10]。本研究发现BBR单独处理MDA-MB-231/ADR细胞时对其并无增殖抑制作用，可能与细胞的强活性特性相关。

ADR作为一种高效、广谱的蒽环类抗菌药物、肿瘤细胞抑制药，广泛用于各种恶性肿瘤的化学治疗，在治疗成人和儿童的实体肿瘤(如乳腺癌、卵巢癌和胃肠道恶性肿瘤) 和血液系统恶性肿瘤(如淋巴瘤和白血病)方面效果良好。研究表明ADR可通过抑制DNA复制和转录过程，诱导自由基的产生和氧化应激，改变钙离子代谢降低肿瘤细胞活性，抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡[11-14]。Barzegar[2]对药物作用的研究显示，BBR单独或联合ADR诱导T47D细胞G2/M期阻滞，MCF-7细胞G0/G1期阻滞，从而显著抑制乳腺癌细胞增殖，诱导乳腺癌细胞凋亡，改变细胞周期分布。BBR还可作为去乙酰化酶功能和细胞质量控制通路的调节剂，降低ADR毒性[15]。还有研究显示，ADR对MDA-MB-231细胞的毒性是BBR的64倍[16]。若在乳腺癌的治疗中能减少ADR的使用，增大BBR的用量，便可很大程度降低心肌的损害并减少机体耐药性。本研究发现采用不同质量浓度ADR处理MDA-MB-231/ADR细胞24 h，ADR对其增殖抑制作用呈浓度依赖性。加入一定质量浓度BBR后，ADR抑制MDA-MB-231/ADR细胞增殖的能力增强，提示BBR可增强MDA-MB-231/ADR细胞对ADR的敏感性，为发现难治性TNBC新的治疗策略，奠定了初步的实验基础。

研究表明，P300是通过募集DNA修复辅助因子或组蛋白乙酰化来促进细胞DNA损伤修复，以此保护恶性肿癌细胞减免化疗药物的杀伤，促进肿瘤细胞耐药性的形成，长此以往会影响患者预后[17-18]。而通过抑制剂等技术下调P300的表达时，肿瘤细胞对于药物的治疗敏感性恢复，耐药性下降。关于酵母菌的研究中发现，DNA损伤会引发细胞周期阻滞，P300表达上调，同时去乙酰化酶SIRT2蛋白表达下调，两者共同作用升高并维持H3K56的乙酰化水平[19-20]，H3K56ac和新DNA双链组装成核小体，进行DNA双链断裂修复，随后P300表达下调，同时去乙酰化SIRT2表达上调，H3K56ac去乙酰化，核小体进出门户关闭，DNA复制终止，细胞进入G2/M期。研究显示，P300与SIRT2所介导的组蛋白H3K56乙酰化和去乙酰化对于基因组稳定性十分重要。这种乙酰化修饰在哺乳动物中的发生和作用也曾有过报道。Vempati等[21]证明了乙酰化的H3K56在哺乳动物细胞中是以细胞周期依赖的方式调节的；并且组蛋白乙酰转移酶P300在体外和体内都能乙酰化H3K56，而SIRT2和SIRT3在体内能去乙酰化H3K56ac。杨宇石等[22]关于MDA-MB-231/ADR细胞的研究显示：MDA-MB-231/ADR细胞中，组蛋白乙酰化转移酶P300高表达，提示在TNBC中，P300可能参与药物刺激后肿瘤细胞中的DNA损伤反应，通过促进DNA修复保护肿瘤细胞免受化疗药物损伤，促进耐药形成。本实验显示，MDA-MB-231/ADR细胞中的P300同样维持较高水平的稳定状态，加入BBR后此平衡状态被打破，P300在BBR组及药物联用组蛋白表达水平呈明显下降，这与Yang等[23]提到的BBR对P300组蛋白乙酰化转移酶的抑制作用相吻合。此时SIRT2的高表达可能是与P300下调或者与激活耐药细胞的保护性自噬机制有关，此现象与汤红霞等[24]针对SIRT2通过自噬机制逆转HL-60/A耐药性的研究结果一致，而P300与SIRT2两者共同作用于H3K56ac，使其表达下调。当BBR联合ADR作用于MDA-MB-231/ADR细胞时，SIRT2上调、H3K56ac下调程度更显著。说明BBR增强细胞对ADR的敏感性可能与SIRT2、H3K56ac蛋白相关。还有研究显示，SIRT2的过表达可以在一定程度上促进胃癌细胞的增殖能力，抑制其表达则降低胃癌细胞的侵袭迁移能力[25]，因此SIRT2过表达也可能促进TNBC耐药细胞的增殖、侵袭、迁移能力。细胞迁移实验显示加药后耐药细胞的迁移能力极低，目前尚未有文献表明其原因，可能与细胞耐药后的惰性有关，有待进一步研究。