B细胞分化浆母细胞及浆细胞的体外模型建立

刘 静,陈惠荣,郭佳琦,马金海

B淋巴细胞又称骨髓依赖性淋巴细胞，由骨髓中的造血干细胞分化发育而来，在人体内合适环境刺激下增殖分化为浆母细胞及浆细胞，而浆细胞合成和分泌免疫球蛋白，在体液免疫反应中起着至关重要的作用[1]。近十年，有越来越多的实验研究B细胞在体外增殖分化为浆细胞的步骤，但过程繁琐且周期长[2-3]。该研究用3个步骤建立从B细胞增殖分化成浆母细胞和浆细胞的体外模型，这种体外模型有助于对浆母细胞及浆细胞的功能进一步研究，也为研究多发性骨髓瘤一类浆细胞发育不良疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料健康捐献者外周血单个核细胞，用CD19 MicroBeads human Isolation Kit分离B细胞，纯度>95%。接种于24孔板进行细胞培养，分为CD40L对照组及CD40L+CpG组，每孔2 ml培养液,B细胞浓度为1.5×103个/L。标本已获得健康捐赠者知情同意。

1.2 试剂与仪器CpG、白细胞介素(interleukin)-2、IL-4、IL-6、IL-21、干扰素α(interferon-α，IFN-α)、April、抗体CD19-PercP-Cy、CD27-PE/Cy7、CD38-APC、CD24-PE、CD138-N421、CD20-FITC、Fc block、培养液均购自美国Sigma公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；BD LSR Ⅱ流式细胞检测仪购自美国BD公司；超净工作台购自苏州市洁净技术研究所；台式离心机购自上海安亭科学仪器厂；温水浴锅和恒温箱购自上海精宏实验设备有限公司。

1.3 实验方法优化B细胞的增殖和分化。步骤1：B细胞激活，将纯化的B细胞以1.5×103个/L浓度置于24孔板的RPMI1640培养液，10% FBS，以0.002 L/孔培养细胞。加入CD40L(0.05 μg/L)、IL-2(0.05 μg/L)、IL-4(0.05 μg/L)或CD40L(0.05 μg/L)、CpG (0.01 μg/L)、IL-2(0.05 μg/L)、IL-4(0.05 μg/L)培养4 d。步骤2：浆母细胞分化，在培养第4天，收集细胞并用培养液清洗，去除CD40L、CpG，加入细胞因子组合：IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)或IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)、IL-21(0.05 μg/L)、IFN-α(0.02 μg/L)促进浆细胞分化3 d。步骤3：浆细胞分化，在培养第7天，洗涤细胞，分别以IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)、April(0.02 μg/L)、IFN-α(0.02 μg/L)或IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)、IL-21(0.05 μg/L)、IFN-α(0.02 μg/L)培养3 d，整个过程共10 d。

1.3.1倒置显微镜下观察不同时期B细胞形态学变化 B细胞激活后体积逐渐增大，在第7天及第10天观察细胞形态变化。在每一个步骤结束用台盼蓝对细胞生存率进行测定。

1.3.2流式细胞仪分析 通过荧光素FITC结合抗CD20抗原，PE结合抗CD38抗原进行多色荧光激活细胞分选,对第7天浆母细胞(CD20-CD38+)进行染色。使用FITC结合抗CD20和PE结合抗CD138抗原对第10天的浆细胞(CD20-CD138+)进行染色。在BD LSR Ⅱ流式细胞仪上直接免疫荧光染色分析细胞。

2 结果

2.1 优化B细胞的增殖和分化用CD40L、CpG、IL-2、IL-4激活B细胞4 d。去除CD40L及CpG，加入IL-2、IL-21促进浆母细胞分化3 d。加入IL-2、IL-6、IFN-α、April促进浆细胞分化3 d，得到浆细胞数量及活性最佳。见表1。

2.2 倒置显微镜下细胞形态变化第7天及第10天倒置显微镜下可见B细胞在分化过程中，形态由球形变为不规则形，胞质丰富，表面光滑，由分散生长逐渐到成簇生长。CD40L组及CD40L+CpG组均可见大量B细胞增殖，在第7天细胞存活率均在80.0%以上，而第10天大量细胞死亡，存活率降至39.0%。

2.3 流式细胞仪对细胞表面分子表达水平检测步骤1：从健康人外周血单个核细胞获得纯化的B细胞，用CD40L+CpG、IL-2、IL-4激活B细胞获得大量活性B细胞。CD40L和CpG同时刺激B细胞激活时，增殖能力会大大增强，并且诱导浆母细胞分化。第4天扩增的细胞中得到40.2% CD20+CD38-细胞，12.6% CD20-CD38++细胞，3.9% CD20-CD38+CD138++细胞。步骤2：在这个阶段CD40L及CpG可以阻止浆细胞进一步分化，故首先去除CD40L及CpG，而IL-2、IL-21可促进浆母细胞分化和存活。如果在步骤1中用CD40L培养细胞，第7天细胞形态无明显差异，但在第7天抗CD20、CD38、CD138抗原标记细胞时发现CD20+CD38-细胞的百分比从40.2%降至10.6%(P=0.000 1，t=0.19),此外还检测到19.8% CD20-CD38+CD138++细胞。对比使用不同的细胞因子组合，加用IL-6及IFN-α组在细胞形态及生长情况无明显差异，得到10.6% CD20+CD38-细胞(P=0.95,t=0.74)，57.9% CD20-CD38++细胞(P=0.91,t=0.76)，19.8% CD20-CD138++细胞(P=0.90,t=0.41)，差异无统计学意义，且存活率均在85.0%以上。由于3 d后浆母细胞将快速死亡，因此第2步骤培养不超过3 d。步骤3：为了避免浆母细胞发生快速死亡，先洗涤细胞，并加入IL-2、IL-6、IFN-α、April培养3 d，此阶段60.0%细胞将死亡。添加细胞生长因子并不能提高细胞存活率。IL-6、IFN-α促进表达CD138的浆细胞生成，而添加IL-21并不能提高浆细胞的生成和存活率(21.0%)，换用April使细胞存活率达39.0%，存活的细胞主要由69.5% CD20-CD38++组成，其中40.1% CD20-CD38+CD138++。见表1，图1、2。

表1 优化体外B细胞增殖分化为浆母细胞及浆细胞的步骤(n=9)

图1 浆母细胞及浆细胞形态

图2 B细胞体外诱导分化表面标记分子

3 讨论

B细胞在外周血、骨髓、次级淋巴组织中循环，接触抗原后增殖分化为浆母细胞，浆母细胞进一步分化为浆细胞，而浆细胞是体液免疫的终末效应物。如果没有合适的条件及环境，B细胞在体外存活时间非常短暂，极大限制对B细胞终端体外分化的轨迹研究[4]。本课题组通过对B细胞激活信号和细胞因子组合的研究，在以往的实验基础上，用3个步骤建立从B细胞增殖分化成浆母细胞和浆细胞的体外模型。

B细胞向浆母细胞及浆细胞的增殖分化受到提供CD40L的滤泡辅助T细胞的帮助和细胞因子提供的信号整合调节，共刺激分子和细胞因子可以促进B细胞的存活、增殖以及分化。CD40L是辅助T细胞表面配体刺激幼稚B细胞以及记忆B细胞增殖，但不能诱导浆细胞分化[5]。首先用表达CD40L的饲养细胞，该细胞支持人类骨髓干细胞的长期培养。CpG可以刺激非T细胞依赖性B细胞的增殖分化，并在后期提示诱导分泌IgM的增加。有研究[6]显示,仅用CpG刺激外周血单个核细胞7 d后，B细胞明显增殖并分化为浆母细胞和分泌的免疫球蛋白，CpG上调了编码BLIMP-1的PRDM1的表达，而BLIMP-1是浆细胞分化至关重要的转录因子。在步骤1中将实验分为2组，CD40L组及CD40L+CpG组，分别加入IL-2、IL-4，已经有研究[7]提示，IL-2、IL-4可以通过ERK/ELK1信号通路的BACH2刺激活化的B细胞增殖。增殖4 d后从倒置显微镜上可以看到B细胞体积逐渐增大，大小均匀，由分散生长逐渐趋化成团状，两组细胞形态无明显差别，细胞存活率均>95.0%。

目前报道有各种方法激活信号和细胞因子组合，以获取最大数量的浆细胞[8]。浆母细胞在外周血中如果没有受到趋化因子受体表达的影响被招募到黏膜或骨髓中，在外周血中存活时间非常短。正因为这些环境为浆母细胞提供生存的必要条件，使其进一步分化成为持久存活成熟的浆细胞。研究表明[9]表达CD40L和CD4+T细胞为B系统提供强大的共刺激信号CD40L和B细胞表面表达的CD40结合可使幼稚B细胞以及记忆B细胞增殖，但不会诱导浆细胞分化，也有研究表明[5，10]CpG在后期会抑制B细胞分化。在步骤2中，首先去除CD40L及CpG，并清洗细胞。自2000年以来，已经有较多T细胞对B细胞的帮助进行详尽的研究，并发现IL-21被认为是重要的细胞因子，人类B细胞向分泌抗体的浆细胞分化的重要因素。IL-21通过STAT1、STAT3、STAT5以及MAPK/ERK和P13K/Akt途径，促进B细胞增殖、浆细胞分化以及大多数细胞分泌[11]。第7天可以观察到CD40L组及CD40L+CpG组细胞形态大小基本相同，表面光滑，可见成簇细胞。在步骤2中加入不同细胞因子组合，已发表的文献提示[10]，IL-6、IFN-α可以促进浆细胞分化，本研究对比后发现在步骤2中加入IL-6、IFN-α对浆细胞的分化没有明显影响。在IL-21 存在的情况下，CD40L诱导B细胞增殖，荧光显微镜下可见细胞团块形成，但它既不促进B细胞增殖，也不诱导浆细胞形成人浆细胞及其前体在体液免疫反应中起着至关重要的作用。流式细胞仪分析可见CD20-CD38++CD138-浆母细胞阶段。

在步骤3中，CD40L组和CD40L+CpG组细胞形态基本相同，细胞存活率均>30%。有研究[12]表明，表达CD40L和分泌IL-21的CD4+T细胞为B系统提供强大的共刺激信号CD40L和B细胞表面表达的CD40结合可使幼稚B细胞以及记忆B细胞增殖，但不会诱导浆细胞分化，April是肿瘤坏死因子家族成员，作为增殖诱导配体，在浆细胞的分化及抗体类别转换的作用越来越受到重视[13]。用April培养3 d，在建模第10天CD20-CD38++CD138++浆细胞表达增加。通过检测提示获得的浆细胞优先来源于记忆B细胞，并具有类似于人骨髓浆细胞的CD138++表型通过模仿T细胞的辅助功能提供CD40L，树突细胞产生的细胞因子，来模仿B细胞增殖和分化过程。除了研究B细胞体外增殖分化外，该体外模型同样对进一步了解多发性骨髓瘤中浆细胞发育不良的分子学具有重要意义，而寻找多发性骨髓瘤骨髓环境是否可以在体外触发这些浆细胞存活[14]，也将带给研究人员新的思路。