TWS119对多发性骨髓瘤细胞增殖及凋亡影响机制研究*

李彦辰，邹 露，熊福龙，戴世溧，张 昊，周 亮

(苏州大学药学院药理系，江苏 苏州 215123)

统计数据表明，多发性骨髓瘤(MM)占肿瘤疾病的1%，是第二常见的恶性血液肿瘤，发病率为每年4.5例/10万人～6.0例/10万人。1990—2016年，由于人口增长、世界人口老龄化使得全球MM的发病率增长了1.26倍[1]。 MM难治愈、易复发，这使了解MM发病机制并研发相应药物成了目前的研究热点和难点。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Btz)是首个批准治疗MM的药物。作为一种缓慢可逆的抑制剂，Btz与26S蛋白酶体的催化位点结合，抑制β5亚基(糜蛋白酶样活性)、β2亚基(胰蛋白酶样活性)和β1 亚基(半胱氨酸蛋白酶样活性)，导致蛋白的降解失衡从而诱导细胞凋亡[2-3]。但单一Btz用药容易出现耐药性，使得研发联合用药新策略成为目前研究的热点。已有研究表明，Btz联合免疫调节药物来那度胺和组蛋白去乙酰化酶阻断剂帕比司他(Panobinostat)，可很好地抑制MM细胞增殖，从而改善MM的临床疗效和预后[4]。

已有激酶抑制剂被应用于临床上治疗肿瘤，例如PI3K激酶抑制剂LY-317615正被用于治疗复发性或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤[5]。但迄今为止，还没有激酶抑制剂被批准用于MM治疗。已有研究表明，TK抑制剂GSK1838705A、FAK/PYK2抑制剂VS-4718和VS-6062，以及p38抑制剂BIRB 796均可抑制MM细胞增殖[6-9]。另外，研究表明p38选择性抑制剂SCIO-469和一种口服BTK抑制剂CC292，可以增强MM细胞Btz敏感性[10-13]，但是其内在作用机制还不是很清楚。caspase信号通路激活能够促进MM细胞凋亡，抑制其增殖[14]。另外，caspase非依赖的凋亡通路在MM细胞凋亡中也有相关报道。例如，GSK1838705A能够通过抑制胰岛素样生长因子-1受体和相关激酶而不是caspase，抑制MM细胞增殖，促进MM细胞凋亡[6]。本研究中，作者利用了糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制剂TWS119，发现TWS119抑制MM细胞增殖，促进其凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 GSK-3β抑制剂TWS119和蛋白酶体抑制剂Btz购于Selleck公司；caspase抑制剂z-VAD-fmk购于碧云天生物技术公司；Calpain抑制剂Calpeptin购于Santa Cruz公司；MM细胞系MM1.S和LP1购于BNCC公司；细胞培养使用胎牛血清(FBS)和1640培养基购于Gibco公司；0.25% 胰蛋白酶和青霉素/链霉素(100×)购于新赛美生物科技有限公司；MM细胞培养瓶购于NEST公司；细胞培养板购于Thermo Scientific公司； anti-PARP1抗体购于Cell Signaling Technology公司； anti-GAPDH抗体购于Proteintech公司；辣根过氧化物偶联的二抗购于Jackson 免疫研究实验室。

1.2方法

1.2.1细胞培养和药物处理 LP1和MM1.S细胞使用1640培养基(10% FBS,1%青霉素/链霉素)进行培养。每2～3天进行细胞传代。用于免疫印迹(WB)实验的细胞接种在24孔板中，接着使用相应药物处理后，收集细胞，进行后续WB实验。用于细胞增殖实验的细胞接种在96孔板中，接着使用相应药物处理后，利用CCK-8增殖检测试剂盒测量细胞增殖情况。

1.2.2WB实验 细胞使用RIPA裂解缓冲液[150 mmol/L Nacl、1% 聚乙二辛基苯基醚(TritonX-100)、0.1% SDS、50 mmol/L Tris-base(pH 7.4)、 1mmol/L EDTA]裂解后，超声破碎，添加5倍聚丙烯酰胺凝脉电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液[250 mmol/L Tris-HCL(pH 6.8)、10% SDS、0.25% 溴酚蓝(BPB)、50% 甘油、5% β-巯基乙醇]，98 ℃处理5～10 min。利用10% 蛋白胶进行SDS-PAGE实验，分离蛋白。转膜后，利用10%脱脂牛奶(3 g脱脂奶粉、30 mL 1倍TBST缓冲液)封闭1 h，接着孵育相应一抗和二抗。最后采用凝胶成像系统Tanon 5200仪器采集图片。

1.2.3CCK-8细胞增殖实验 具体步骤参考CCK-8增殖检测试剂盒说明书。在96孔板上接种MM细胞，接种密度为每孔1 000个细胞/200 μL培养基。接着使用相关药物处理，培养指定时间后，加入20 μL的CCK-8溶液(5 mg/mL)。接着继续培养2 h，最后使用酶标仪测定吸光度值(450 nm)。每个实验进行3～4次生物学重复。

1.2.4具体操作 (1)首先使用TWS119处理LP1和MM1.S 24 h后，收集细胞，并且进行WB实验。作者使用经典的凋亡信号分子人聚(ADP核糖)聚合酶1(PARP1)来考察MM细胞凋亡。同时，为了研究MM细胞增殖情况，使用TWS119处理LP1和MM1.S细胞6 d，运用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。(2)已有研究表明，10 μmol/L z-VAD-fmk处理细胞24 h就能够比较好地阻断细胞内caspase信号通路，进而抑制细胞凋亡[15-16]，同时10 μmol/L TWS119处理24 h能够比较好地诱导细胞凋亡[17]。基于此，本研究采用10 μmol/L z-VAD-fmk预处理LP1细胞30 min，接着使用10 μmol/L TWS119处理LP1细胞24 h，利用WB实验及CCK-8试剂盒检测LP1细胞凋亡、增殖。(3)为进一步证明，利用蛋白酶体抑制剂Btz来诱导LP1细胞凋亡。采用10 μmol/L z-VAD-fmk预处理LP1细胞30 min，接着使用10 μmol/L Btz处理LP1细胞24 h，利用WB实验检测LP1细胞凋亡。另外，已有研究表明蛋白水解酶Calpain能够切割PARP1[18]，本研究利用Calpain抑制剂Calpeptin(10 μmol/L)来预处理LP1细胞，进而使用10 μmol/L TWS119处理LP1细胞24 h，利用WB实验检测LP1细胞凋亡。(4)本研究进一步研究了TWS119和Btz在人源MM中联合用药的效果。通过联合10 μmol/L TWS119和10 μmol/L Btz处理LP1细胞24 h，利用WB实验及CCK-8试剂盒检测细胞凋亡和增殖。

1.3统计学处理 采用GraphPad Prism Version 6.02软件进行统计学分析，进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1TWS119对MM细胞凋亡及增殖影响 TWS119分别处理LP1和MM1.S细胞24 h、6 d后，显著诱导LP1和MM1.S中PARP1切割(图1A、C)，即诱导细胞凋亡；显著抑制LP1和MM1.S细胞增殖(图1B、D)。与对照组[二甲基亚砜(DMSO)]比较，TWS119促进LP1和MM1.S细胞凋亡及抑制LP1和MM1.S细胞增殖均差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2TWS119通过caspase非依赖方式影响MM细胞凋亡及增殖 caspase抑制剂z-VAD-fmk不能抑制TWS119诱导的LP1细胞凋亡(图2A)，即TWS119诱导MM细胞凋亡是通过caspase非依赖方式。 另外，caspase抑制剂z-VAD-fmk也不能缓解TWS119对LP1细胞增殖的抑制作用(图2B)，即TWS119抑制MM细胞增殖是通过caspase非依赖方式。caspase抑制剂z-VAD-fmk能够显著抑制Btz诱导的LP1细胞凋亡(图2C)。与z-VAD-fmk、Btz比较，TWS119促进LP1细胞凋亡及抑制LP1细胞增殖均差异有统计学意义(P<0.05)。另外，Calpain抑制剂Calpeptin不能抑制TWS119诱导的LP1细胞凋亡(图2D)，即TWS119诱导MM细胞凋亡是通过caspase和Calpeptin非依赖方式。与Calpeptin比较，TWS119促进LP1细胞凋亡及抑制LP1细胞增殖均差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

A、C.LP1、MM1.S细胞使用TWS119处理24 h后，进行WB实验检测凋亡；B、D.LP1和MM1.S细胞使用TWS119处理6 d后，进行CCK-8实验检测增殖；TWS119与DMSO比较，a P<0.05。

A、B.caspase抑制剂z-VAD-fmk预处理LP1细胞，接着使用TWS119进行处理，行WB、CCK-8实验检测凋亡和增殖；C.caspase抑制剂z-VAD-fmk预处理LP1细胞，接着使用Btz进行处理，行WB实验检测凋亡；D.Calpain预处理LP1细胞，接着使用TWS119进行处理，行WB实验检测凋亡；联合Btz和z-VAD-fmk与单独Btz比较，a P<0.05；联合TWS119和z-VAD-fmk或Calpeptin与单独TWS119比较，b P>0.05。

2.3TWS119增加MM细胞Btz敏感性 联合用药在促进LP1细胞凋亡方面具有最明显的效果(图3A)，TWS119能够显著增加Btz诱导的细胞凋亡。联合10 μmol/L TWS119和2 μmol/L Btz能够显著抑制LP1细胞增殖(图3B)，TWS119能够显著增强Btz对MM细胞增殖的抑制作用。与Btz比较，TWS119增加Btz诱导的细胞凋亡及增强Btz对MM细胞增殖差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

A、B.LP1细胞使用TWS119和(或)Btz处理后，行WB、CCK-8实验检测凋亡和增殖；联合TWS119和Btz与单独TWS119和单独Btz比较，a P<0.05。

3 讨 论

本研究中，作者利用蛋白PARP1切割来证明MM细胞凋亡，在2种人源MM细胞中发现GSK-3β小分子抑制剂TWS119能够促进MM细胞的凋亡。同时利用CCK-8细胞增殖检测试剂盒发现TWS119能够显著抑制2种MM细胞的增殖。最后，联合TWS119和临床上用于治疗MM的药物Btz处理MM细胞，证明TWS119能够显著增加MM细胞Btz敏感性。

分子机制上已有研究表明，诱导caspase激活能够促进MM细胞凋亡并且抑制其增殖[14]。 因此，作者考虑了caspase通路在TWS119杀伤MM细胞中的作用。但本研究发现，caspase抑制剂z-VAD-fmk能够显著抑制Btz的毒性，但是并不能够抑制TWS119在MM细胞中的毒性。这说明TWS119不是通过激活caspase通路来抑制MM细胞增殖，促进MM细胞凋亡。已有研究表明，通过稳定p53和抑制STAT3信号通路也能够诱导骨髓瘤细胞周期停滞和凋亡[19]。

caspase的激活能够切割PARP1，同时已有研究表明，Calpain和Cathepsin等蛋白酶也能够切割PARP1，进而调控细胞凋亡[20]。这些caspase非依赖的PARP1切割和凋亡，是否参与了TWS119在MM细胞中的毒性作用，针对这一问题，作者利用Calpain抑制剂Calpeptin预处理LP1细胞，发现Calpeptin也不能抑制TWS119诱导的PARP1切割，这说明TWS119诱导的细胞凋亡不依赖于Calpain通路。可见，本研究证明了TWS119诱导的MM细胞凋亡不依赖于经典的caspase和Calpain通路，其内在的具体通路还需要进一步研究。

Btz能够明显促进MM细胞凋亡，抑制其增殖，从而被临床应用于治疗MM，但单一Btz用药容易产生耐药性。研究表明，长期Btz处理可能影响Btz与PSMB5的结合，从而产生耐药性[21]。另外，也有文献报道长期单一使用Btz所产生的耐药性也与丝氨酸的合成增加有关[22]。如何增加Btz敏感性，是目前基于Btz治疗中亟待解决的问题。本研究中，作者联合TWS119和Btz处理MM细胞，对比单一TWS119和Btz用药，联合TWS119和Btz用药在促进MM细胞凋亡和抑制其增殖方面效果最为明显。这说明TWS119能够增加MM细胞Btz敏感性。Btz诱导的MM细胞毒性依赖于caspase通路，而TWS119诱导的MM细胞毒性不依赖于caspase通路，这使得在MM细胞中联合Btz和TWS119用药，能够通过caspase依赖和非依赖的方式促进MM细胞凋亡，并且抑制其增殖。本研究为二者联合用药提供了一定的理论基础。

总之，本研究发现GSK-3β小分子抑制剂TWS119可促进MM细胞凋亡，抑制其增殖。同时也证明了TWS119能够显著增加MM细胞Btz敏感性。联合TWS119和Btz处理MM细胞的实验结果为MM疾病治疗提供了新思路和新策略。