加减薯蓣丸治疗阿尔茨海默病药理作用及分子机制研究*

马峥玲，谭子虎,2△，尹茜茜，庄诗瑶，徐乐乐

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2.湖北省中医院，湖北 武汉 430061)

阿尔茨海默病(AD)是最常见的痴呆类型，据估计2050年全球痴呆患者人数将达1.15亿，其中约2/3为AD患者[1]。其患病群体庞大、医疗护理繁杂，给家庭和社会带来沉重负担。如何实现有效的神经再生，改善认知，提高患者及其家属生活质量，是AD治疗面临的主要挑战[2]。中医论治痴呆历史久远且临床行之有效，以整体调节、不良反应少等优势被广泛关注[3]。

AD在中医学中属“痴呆”范畴，病机总归脾肾亏虚，无以充养髓海，加之痰瘀阻窍，渐至髓减脑消，发为本病。薯蓣丸源于《金匮要略》，乃仲景“虚劳风气百疾”之代表方，具有气血同调、散收相因、功专理脾的特点[4]。本方由湖北省中医院名老中医吕继端教授结合临证经验，去其祛风之性，酌加滋肾化瘀之品，加减用于临床，取得较好疗效。前期研究发现，加减薯蓣丸能有效改善AD患者认知功能和日常生活能力[5]，说明加减薯蓣丸对AD的潜在疗效，具有广泛的研究空间。为挖掘加减薯蓣丸对AD的潜在作用机制，本研究基于网络药理学对加减薯蓣丸干预AD可能的分子生物学机制进行探讨，并通过分子对接技术对关键药物成分及靶点进行验证，旨在为后期进一步研究加减薯蓣丸干预AD作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1材料来源 使用中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php)检索各中药的化学成分，依据口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18进行筛选。TCMSP数据库查询所有活性成分靶标蛋白，经Uniprot蛋白数据库(https://www.uniprot.org/)校正确定已验证人源基因名称。对TCMSP数据库中未查询到靶标蛋白的活性成分，利用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)收集其结构信息，经 SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)行靶标预测，取可信度高的靶点。最后将通过上述方法收集到的加减薯蓣丸药物活性化学成分与靶点进行汇总。

1.2检索AD疾病靶点 基于GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)、Drugbank数据库(https://go.drugbank.com/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)，以“Alzheimer disease”为搜索词，检索与疾病相关的作用靶点，将检索得到的疾病靶点汇总去重。

1.3获取加减薯蓣丸治疗AD潜在靶点 将AD疾病基因与加减薯蓣丸作用靶点取交集，获取共同靶点，即为加减薯蓣丸作用于AD的潜在作用靶点。然后通过Cytoscape 3.6.1软件构建加减薯蓣丸治疗AD的“中药-活性成分-靶点”网络，并进行分析。

1.4构建蛋白质相互作用网络 将潜在靶点导入STRING数据库(https://string-db.org/)，构建蛋白相互作用(PPI)网络。使用Cytoscape 3.6.1软件分析PPI结果，依据度值、介度值、中心度值等拓扑学分析结果筛选出核心网络。

1.5基因本体(GO)功能富集分析和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 运用Metascape数据库(http://metascape.org/gp/index.html)对交集基因行GO功能、KEGG通路富集分析。所得结果中活性成分靶点基因更集中的通路，被认为是加减薯蓣丸治疗AD的重要调节通路。

1.6分子对接 运用AutoDockVina 1.5.6将加减薯蓣丸方中的关键化学成分和潜在作用靶点中度值排名前5的靶点进行分子对接试验。使用PubChem数据库下载核心化合物sdf结构文件，导入Chem 3D软件调整化合物空间构想，保存为“mol 2”格式，经AutoDockVina 1.5.6分配电荷、设置可旋转键后保存为“pdbqt”格式。

从PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)下载核心靶点的3D晶体结构，使用PyMol软件去除靶蛋白水分子，分离原始配体和受体后导入AutoDockVina 1.5.6，加氢、分配电荷、添加原子类型后保存为“pdbqt”格式。使用AutoDockVina 1.5.6进行分子对接，计算结合能大小。

2 结 果

2.1加减薯蓣丸活性化学成分筛选 使用TCMSP数据库筛选出加减薯蓣丸各味中药符合条件的活性化学成分，其中白芍14个，白术7个，川芎7个，当归2个，党参21个，茯苓15个，枸杞子45个，山药16个，石菖蒲4个，熟地2个，五味子8个，汇总去重后共获得103个活性成分。经UniProt数据库均一化获得药物靶点，去重后共获得536个候选靶点。

2.2药物-疾病交集靶点筛选 以“Alzheimer disease”为搜索词，检索GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD数据库，筛选与疾病相关且可信度高的作用靶点，汇总去重后共获得1 966个疾病靶点。

2.3中药活性成分-作用靶点网络构建及核心化合物分析 将2.1中筛选得到的536个候选作用靶点与AD疾病基因取交集，得到243个交集靶点，即加减薯蓣丸作用于AD的潜在作用靶点。通过对潜在靶点反向推导，得出药物作用于AD的化合物共82个，使用Cytoscape 3.6.1软件将82个化合物及243个交集靶点进行关联，构建中药活性成分-作用靶点网络图。发现作用靶点最多的前10个关键成分，依次为槲皮素、猪苓酸C、齿孔酸等，度值为19～100，具体见表1。故推测这些成分为加减薯蓣丸治疗AD关键活性成分。

2.4PPI网络构建及核心靶点筛选 将243个潜在作用靶点上传至STRING数据库即可得到PPI网络图，文件以“tsv”格式保存。保存的“tsv”文件上传至Cytoscape 3.6.1软件，先以度值大于2倍中位数初次筛选网络，再以网络中节点介度值(中位数为4.837)、中心度值(中位数为0.902)、度值(中位数为97)等参数大于中位数筛选得到核心靶点22个(图1)。其中MAPK3、AKT1、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、VEGFA为度值排名前五的靶点基因。

2.5GO功能和KEGG通路富集分析 使用Metascape数据库将取得的交集基因进行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能分析包括生物过程、细胞成分和分子功能3个水平，分别选取富集程度最高的前10个。在生物过程中，靶点主要涉及对氮化物的反应(cellular response to nitrogen compound)、炎症应答(inflammatory response)及创伤反应(response to wounding)。在细胞组成中，靶点主要涉及膜阀(membrane raft)、树突(dendrite)、突触后膜(postsynapse)等。分子功能主要涉及G蛋白耦连胺受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白激酶连接(kinase binding)等。见图2。

图2 GO功能富集分析结果图

KEGG通路富集分析选取富集程度最高的前20条通路，交集靶点主要富集于癌症通路、晚期糖基化终产物(AGE)-RAGE信号通路、PI3K-AKT信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路、麻疹通路、cAMP信号通路、NF-κB信号通路等，提示上述通路与加减薯蓣丸干预AD的发生、发展密切相关。见图3。

图3 KEGG通路富集分析结果图

2.6分子对接验证 依据2.3中筛选出的药物干预AD的关键活性成分与2.4中度值排名前五的靶蛋白进行分子对接。当结合能小于0时，认为关键活性成分与靶蛋白可自由结合，且结合自由能越低，二者结合能力越强。结果显示，主要成分与靶蛋白结合活性均较高。表明10种化合物均与靶蛋白受体间具有较佳的结合效能。见图4。

图4 加减薯蓣丸核心化合物与核心靶点对接结合能热图

3 讨 论

加减薯蓣丸始于《金匮要略》，由吕继端教授根据痴呆“脾肾亏虚、痰瘀互结”之病机加减而成。方中山药、熟地、枸杞子、五味子健脾补肾、填精益髓，以资先天；党参、白术、茯苓益气健脾、化痰祛湿，以实中土；当归、川芎养血活血，以祛瘀开窍；白芍敛阴柔肝以滋阴液不足。诸药为伍，水土合补，痰瘀得除，从而延缓疾病进展。

从加减薯蓣丸活性成分-作用靶点网络及分子对接结果中分析可知，2.3中筛选出的化合物可能为加减薯蓣丸干预AD的关键活性成分。槲皮素为一种黄酮醇，其神经保护作用在许多体内外试验中得到证实。其可通过抗氧化应激、抗炎[6]、消除谷氨酸介导的兴奋毒性[7]、抑制胆碱酯酶活性[8]、诱导自噬拮抗Aβ1-42介导的神经毒性[9]等途径减轻AD症状。β-谷甾醇为白芍、当归、枸杞子共有成分，可通过血-脑屏障在脑中积累，发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡和神经保护等生物学活性[10]。有研究发现，β-谷甾醇可显著降低APP/PS1小鼠Aβ40和Aβ42沉积、抑制BACE1的表达，增加树突棘密度，改善APP/PS1小鼠行为学表现[11]。豆甾醇作为一种类固醇衍生物，易通过血-脑屏障，因其双键结构易被氧化，可作为有效的抗过氧化剂，且豆甾醇可激活Erk-Creb信号，诱导突触发生和增强突触可塑性，改善记忆损伤，起到神经保护的作用[12]。

KEGG通路富集分析结果显示，与AD相关的前三名通路分别为AGE-RAGE信号通路、PI3K-AKT信号通路、cAMP信号通路。AGE-RAGE信号通路在AD、糖尿病及其他年龄相关性疾病中破坏性影响十分突出[13]。研究发现，AGEs可直接或通过作用其受体RAGE激活小胶质细胞，诱导小胶质细胞释放IL-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α，且RAGE受体活化后可进一步激活ROS相关的转录因子NF-κB等，从而导致炎性反应和氧化应激[14]，影响学习记忆功能。近年来，糖尿病脑病与 AD相关的说法逐渐被关注，而胰岛素受体底物的主要下游途径之一便是PI3K/AKT级联反应[15]。PI3K/AKT信号通路是控制细胞存活、代谢、生长、分化的重要调控通路，在信号通路间的通信过程中起承转作用。其对AD的作用不是单向的，一方面过度激活的PI3K/AKT通路在AD发病机制中发挥着重要作用，致神经元过度活跃，传递错误信号，产生损伤，且抑制自噬对Aβ的清除作用，减少斑块清除[16]；另一方面，有研究者在AD动物模型中观察到PI3K/AKT信号通路被明显抑制[17]，激活该信号通路可调节神经发生、提高AD模型鼠认知能力[17]。cAMP信号通路作为广为人知的可调节学习及记忆功能的第二信使[18],其不仅能调节兴奋性谷氨酰胺能和胆碱能突触的可塑性，还可作用于突触后膜的γ-氨基丁酸受体，抑制GABA能神经元的调节作用，从而提高学习和记忆能力[19]。

PPI网络筛选出的核心靶点中，TNF与加减薯蓣丸各主要作用成分结合较其他靶点更紧密。TNF已被证明在中枢神经系统中具有重要功能，包括损伤介导的小胶质细胞和星形胶质细胞激活、血-脑屏障渗透性调节、谷氨酰胺的传递、突触可塑性及突触缩放的调节等[20]。有研究者在死亡AD患者大脑中发现淀粉样斑块周围区域TNF水平升高[21],且外周血清TNF水平升高与AD疾病进展有关[22]。已有实验验证加减薯蓣丸可提高AD模型鼠学习记忆能力，其机制可能与海马TNF-α表达被抑制相关[23]，进一步说明筛选结果的可靠性。

综上所述，加减薯蓣丸可能通过槲皮素、猪苓酸C、齿孔酸、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇等活性成分，作用于MAPK3、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA等关键靶点，调控AGE-RAGE信号通路、PI3K-AKT信号通路、cAMP信号通路、NF-κB等信号通路，发挥抗感染、抗氧化应激、调节突触可塑性、调控细胞凋亡等作用，体现了中医药干预疾病多成分、多靶点、多通路的作用特点。

AD是一种复杂的神经系统退行性疾病，其发病与突触可塑性改变、特定神经递质减少、钙超载、氧化应激、炎症、细胞凋亡和神经元死亡等相关。使用单体成分对其治疗作用有限，并伴有明显赖药性及显著不良反应。而整体调节、多药兼容为中医治疗的特色与精髓。加减薯蓣丸干预AD的临床效果已得到有效验证。但由于配方化学成分的复杂性，其作用机制尚未得到明确解释。本研究结合网络药理学及分子对接等技术手段，通过全面系统地阐明加减薯蓣丸干预AD的神经保护作用潜在分子机制，为探索加减薯蓣丸药理作用提供了参考。