五种大蒜DNA 提取方法的比较研究

李姗姗 赵民楷 冯丹彦 阮铃茹 王小敏*

（玉林师范学院 生物与制药学院，广西 玉林 537000）

大蒜（Allium sativumL.），俗称蒜头，胡蒜，独蒜等，属于半年生草本植物，百合科葱属，为广义大蒜的地下鳞茎[1]。大蒜是重要的调料和经济作物，蒜苗、蒜薹是重要的蔬菜。大蒜含一种天然的广普抗生素，具有很强的杀菌能力，对多种病原菌和多种微生物具有杀灭作用[2]。目前，对大蒜的研究主要集中在其农艺性状、产量以及其有效成分的提取上，在提取大蒜DNA 方面的研究较少。因此，寻找一种可以简便、迅速、安全、有效的大蒜基因组DNA 的提取方法成为很多研究者的共识。姚琼凤对大蒜的提取采用十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）法、简化CTAB 法、改良十二烷基硫酸钠（SDS）法[3]。本研究通过CTAB法、SDS 法、尿素法、试剂盒法、高盐低pH 法这五种不同的方法分别对玉林大蒜鳞茎的DNA 进行提取，分析对比不同方法对玉林大蒜鳞茎DNA 的提取效果，给同科属及不同品种的植物DNA 提取提供一定的参考依据，为大蒜分子育种以及遗传转化中DNA 的提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大蒜：来自于玉林仁东本地种植的大蒜。将新鲜采摘的大蒜鳞茎洗净，自然晾干后剪碎，-80℃冻存待用。

1.2 DNA 的提取

1.2.1 SDS 法提取DNA

精密称取1g 大蒜鳞茎，低温研磨，置于1.5mL离心管中。往离心管中加入700μL1.5%SDS和10μLβ-巯基乙醇，充分混匀后65 ℃保温30min，每隔10min 轻摇一次。加入700μL 苯酚、氯仿、异戊醇（25241），37℃保温20min。加入-20℃预冷的异丙醇1mL，-20℃保存30min 后，4℃下10000rpm离心10min。将沉淀转移至新1.5mL离心管中，加入1.5mL70%乙醇，轻摇5min，4℃下10000rpm 离心10min，收集沉淀，并重复1-2次。弃乙醇，超净环境中5min 晾干，加入50μL的TE 缓冲液，待DNA 溶解后-20℃下保存备用。

1.2.2 CTAB 法提取DNA

根据陈恒宇[4]等DNA 提取方法，略有改进。CTAB 提取液65℃预热，异丙醇和氯仿异戊醇（241）混合液4℃预冷。精密称取1g 大蒜鳞茎，低温研磨，置于1.5mL 离心管中。向1.5mL 离心管中加入650μL CTAB 提取液，充分混匀1min，65℃保温40min，每隔10min 上下颠倒3-4 次。加入650μL 预冷氯仿异戊醇（241）混合液，轻摇5min。于12000rpm 下离心10min，取上清液置新1.5mL 离心管中，加入上清液体积1/2 的预冷异丙醇，边颠倒混匀边观察溶液变化，可见少量DNA 沉淀析出，析出DNA 呈白色絮状或白色浑浊状。在10000rpm 离心10min，取DNA 沉淀加600μL 无水乙醇洗涤，在12000rpm 离心5min，洗涤沉淀1-2 次。超净环境中晾干后加80μL TE缓冲液溶解，-20℃保存备用。

1.2.3 尿素法提取DNA

尿素法参照文献[5]，并做修改。DNA 抽提液65℃预热，抽提液与亚硫酸氢钠500:1 比例加入亚硫酸氢钠，溶解，65℃保温。精密称取1g 大蒜鳞茎，加入2.5mLDNA 抽提液（65℃），低温研磨，置1.5mL 离心管中于65℃保温30min，每隔10min 摇匀一次。吸取混合液置于新的1.5mL 离心管中，等体积加入氯仿异戊醇（241）混合液，15000rpm 离心15min，取上清液置新1.5mL 离心管中，加2 倍体积预冷的95%乙醇，把DNA 沉淀置新1.5mL 离心管中，加适量体积的70%乙醇洗涤，10000rpm 下离心1min，重复洗涤3 次。弃上清液，超净环境中晾干，加入适量体积的TE 缓冲液，65℃溶解。加入与TE 缓冲液等体积的苯酚氯仿（11）混合液，15000rpm 下离心5min。将上清液置于新的1.5mL 离心管中，加等体积氯仿异戊醇（241）混合液，15000rpm 下离心5min。将上清液置新1.5mL 离心管中，加入其体积1/10的3mol/L 的醋酸钠溶液，再加总体积2 倍预冷的95%乙醇，混匀后-20℃下放置12h。15000rpm下离心10min，70%乙醇重复洗涤3 次，加入适量TE 缓冲液65℃溶解后于-70℃下保存备用。

1.2.4 试剂盒法提取DNA

选用TaKaRa 公司mini BEST Plant Genimic DNA Extraction Kit 型试剂盒。精密称取1 g 大蒜鳞茎，低温研磨，置于1.5mL 离心管中。1mL Buffer HsII 与20μL 的RNase A混合液56 ℃保温10min。加125μL 的Buffer KAC，冰上放置5min。12000rpm 离心5min。取上清液置新1.5mL离心管中，加等体积Buffer GB，混合后置吸附柱上。12000rpm 离心1min，弃废液，加500μL的Buffer WA，12000rpm 离心1min，弃废液。加700μL 的Buffer WB，重复离心1 次。12000rpm空柱离心2min。弃吸附管，加40μL 的Buffer，静置5min，12000rpm离心2min，-20℃下保存备用。

1.2.5 高盐低pH 法提取DNA

精密称取1g 大蒜鳞茎，加入少量PVP 低温研磨置1.5mL 离心管中。加750μL 高盐低pH 提取液，65℃保温40min，隔10min 取出混匀1 次。12000rpm 离心10min，取上清液置新1.5mL 离心管中。加等体积2.5mol/LNaAc（pH4.8）溶液，4℃下静置30min。12000rpm 离心2min，弃沉淀，加入上清液2/3 体积的氯仿异戊醇（241）混合液，重复1 次。取上清液置1.5mL 离心管中，加2/3体积无水乙醇，-20℃静置60min。8000rpm 离心5min，取DNA 沉淀70%乙醇洗涤3 次。晾干，加100μL TE 缓冲液溶解，-20℃保存备用。

1.3 DNA 质量检测

吸10μL 不同方法提取所得的DNA 溶液，加290μL 的蒸馏水稀释至300μL，使用北京普析通用仪器有限公司TU-1901 双光束紫外可见分光光度计分别测其260nm 和280nm 波长处的吸光值透光率[6]，通过A=-lgT=ECL 计算吸光值，分析判断其浓度与纯度。

琼脂糖凝胶制备（含1%琼脂糖与1%核酸染液），取2.5μL 10X Loading Buffer 与4.5μL DNA样品混合，再吸取2μL Marker，依次上样，电泳检测，凝胶成像系统下观察并记录结果。

2 结果与分析

2.1 紫外分光结果分析

分别对采用5 种不同方法提取的玉林大蒜鳞茎DNA 溶液其纯度和浓度进行检测，结果见表1。

表1 DNA 浓度及A260/A280 值

尿素法、高盐低pH 法和CTAB 法提取的DNA 其A260/A280的值分别为1.830、1.791 和1.758，在1.8 左右，纯度较高。试剂盒法、SDS法提取的DNA 其A260/A280 的值分别为1.352 和1.380 小于1.6，纯度较差。CTAB 法提取的DNA浓度最高，为798.33μg/mL，SDS 法次之，为669.667μg/mL，尿素法为590.667μg/mL，高盐低pH 法为238μg/mL，试剂盒法提取浓度最低，为102.833μg/mL。由此可知：高盐低pH法，CTAB 法，尿素法都能提取到纯度较好的DNA，CTAB 法所得的DNA 浓度最高，试剂盒法提取的DNA 浓度最低。

2.2 琼脂糖凝胶电泳结果分析

采用5 种方法提取的玉林大蒜鳞茎DNA 通过琼脂糖凝胶电泳检测后结果如图1 所示。

图1 琼脂糖凝胶电泳图

由图1 可看出，泳道1 的CTAB 法，所提取的DNA 条带最为明亮，泳道2 的SDS 法提取DNA条带亮度次之，泳道4 的尿素法提取的DNA 条带较SDS 法稍暗。泳道3 的试剂盒法和泳道5 的高盐低pH 法提取的DNA 条带亮度相差较小，跟前三种方法比较，这两种方法提取的DNA 条带较暗。DNA 条带亮度与上述浓度相对应。CTAB 法的点样孔处明显发亮，表明该法提取的DNA 中可能含有没被除掉的蛋白质、多糖和一些其它的次生代谢产物，这些物质具有粘黏性，易跟DNA 结合形成复合物。CTAB 法、SDS 法、尿素法，这三种方法提取的DNA 条带都有不同程度的弥散，说明DNA 完整性不好，其中CTAB 法弥散最严重，SDS 法次之，尿素法DNA 条带弥散拖尾程度最轻。

3 结论

影响植物DNA 提取质量的因素主要是多酚类及多糖类物质[7]，大蒜中含有大量的多酚类物质和多糖[8-9]，因此在提取大蒜DNA 的过程中，多糖和多酚类物质的去除，直接决定着提取的DNA质量。

1）DNA 浓度上，CTAB 法、SDS 法、尿素法提取的DNA 浓度均在500μg/mL 以上，而试剂盒法和高盐低pH 法提取的DNA 浓度较低；

2）DNA 纯度上，CTAB 法、尿素法、高盐低PH 法提取的DNA 的A260/A280 的值均在1.8 左右，纯度很高，而试剂盒法、SDS 法提取的DNA的A260/A280 的值都远远小于1.6，说明DNA 样品中蛋白质或酚污染较严重；

3）电泳条带亮度上，CTAB 法、SDS 法、尿素法提取的DNA 条带亮，试剂盒法和高盐低pH法提取的DNA 条带暗；电泳条带弥散程度上，试剂盒法和高盐低pH 法弥散均不明显，CTAB 法弥散最严重，且点样孔有明显发亮，SDS 法弥散次于CTAB 法，尿素法介于SDS 法和试剂盒法、高盐低pH 法之间。

试剂盒法操作简便，安全无毒，但成本较高，且其裂解系统对大蒜多糖和多酚类物质的去除不如其它四种采用苯、酚、氯仿、异戊醇对DNA 进行抽提的效果好。尿素法用了苯、酚混合液和氯仿、异戊醇混合液对DNA 进行了两次抽提，同时也用了乙醇溶液对DNA 沉淀进行了多次洗涤，操作条件温和，DNA 损伤较小，所得DNA 质量相较于其它四种方法为最好。通过比较分析，最适合玉林大蒜鳞茎DNA 的提取方法是尿素提取法。