高效液相色谱法测定复方黄黛片中丹酚酸B的含量

周文艳，王宇明，黄雁，程世云

作者单位：1合肥亿帆生物医药有限公司，安徽 合肥230061；

2安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥230051

复方黄黛片由青黛、雄黄、太子参、丹参等四味中药组成，本品具有清热解毒，益气生血的功效，临床用于初治的急性早幼粒细胞白血病［1-5］，治疗效果确切，现已收录入国家医保药物目录。复方黄黛片现行标准为国家食品药品监督管理局标准（标准号YBZ13122009），标准中对主药雄黄、青黛进行了含量控制，丹参也进行了质量控制，只采用原儿茶醛的薄层色谱鉴别作为质量控制方法，此法专属性不强，为更好控制该制剂的质量，本研究于2018 年5月至2019 年3 月采用重现性和专属性均较好的高效液相色谱法测定样品中水溶性成分丹酚酸B的含量［6-11］。方法学研究结果表明：该方法准确度高，重现性好。

1 仪器与试剂

岛津LC-20AT 型高效液相色谱仪；瑞士梅特勒XP205 型电子天平；Agilent Zorbax SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm，5µm）色谱柱。

丹酚酸B 对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号111562-201716，对照品含量94.1%，供含量测定用）；复方黄黛片样品（天长亿帆制药有限公司提供，批号170201、170202、170701、171101、180101、180301、180401、180501、180901、180902、180903、181201、181202）。甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件Agilent Zorbax SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长286 nm，柱温35 ℃，进样量10µL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品适量，加甲醇稀释制成100.76 mg/L 的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品20 片，除去包衣，研细，取约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲酸-甲醇-水（1∶80∶19）溶液25 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）20 min，放冷，加甲酸-甲醇-水（1：80：19）溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按标准制法［11］，制备缺丹参的阴性样品。取阴性样品适量，按照“2.2.2”项下方法操作，制得丹参阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性 分别精密移取供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液各10 µL 注入液相色谱仪，进样分析，结果丹酚酸B 峰保留时间为21.1 min，分离度为9.5，阴性样品在丹酚酸B峰位置处无干扰。

2.3.2 线性关系的考察 分别精密移取对照品母液（溶液浓度：1 007.6 mg/L），加甲醇稀释成10.076 mg/L、20.152 mg/L、40.304 mg/L、60.456 mg/L、80.608 mg/L、100.76 mg/L、151.140 mg/L 浓度的溶液，精密移取10 µL 注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积对溶液浓度（mg/L）进行线性回归，得回归方程Y=12 390.60X+5 567.12（r=0.999 9，n=7）。结果表明：丹酚酸B 在10.076～151.140 mg/L 范围内，峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验 精密移取丹酚酸B对照品溶液10µL，重复进样6 次。结果丹酚酸B 峰面积的相对标准差为0.8%（n=6），表明进样精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批复方黄黛片（批号181201）的样品6份，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，测定供试品中丹酚酸B的含量，计算样品中丹酚酸B 的平均含量为2.436 3 mg/g，相对标准差为0.9%。实验表明：样品测定重现性良好。

2.3.5 溶液稳定性试验 取“2.3.4”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，于0、2、4、8、12、16、24 h进样测定，结果丹酚酸B 峰面积的相对标准差为0.5%。结果表明在24 h内供试品溶液稳定。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的供试品（批号181201，含量2.436 3 mg/g）6 份，每份取0.25 g，精密称定，置锥形瓶中，分别精密加入浓度为134.563 mg/L 的丹酚酸B 对照品溶液5 mL，按“2.2.2”项下方法制备溶液，依法测定，计算。加样回收率结果见表1。此方法丹酚酸B 的平均回收率为95.62%，相对标准差为1.6%。

表1 丹酚酸B准确度试验结果

2.3.7 耐用性试验 分别采用Agilent Zorbax SBAq C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）、Waters Sunfire®C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）及phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）三种不同的色谱柱，并分别在岛津LC-20AT 型液相色谱仪及Agilent 1260 型液相色谱仪上测定，结果平均含量为2.363 mg/g，相对标准差为2.8%，岛津LC-20AT 型液相色谱仪检测丹酚酸B 峰的分离度为9.5，Agilent 1260型液相色谱仪检测丹酚酸B 峰的分离度为13.1，耐用性试验结果良好。

2.4 样品含量测定取复方黄黛片13 批，按照“2.2.2”项下方法测定丹酚酸B 的含量，结果见表2。

表2 样品中丹酚酸B含量测定结果

3 讨论

3.1 指标性成分的选择复方黄黛片是黄世林教授依据传统中医中药理论，以驱邪复正为治疗原则，结合长期的临床实践研制的纯中药制剂。依据白血病的病因病机关键是邪毒内蕴、骨髓瘀滞，病变实质为邪实而致本虚的认识，提出“祛邪复正”的主要治疗原则，以解毒清热、益气活血为治法组方。方中主要成分为雄黄、青黛、太子参及丹参，丹参在处方中作为佐使药，其水溶性成分在活血生血及肿瘤抑制方面有明确的作用，且水溶性成分中丹酚酸B 明显高于其他成分［11-12］，本研究选择丹酚酸B 作为指标控制成分。

3.2 检测波长的选择对丹酚酸B 对照品溶液于200～400 nm 进行扫描，其最大吸收波长为286 nm，与文献［11］报道的286 nm一致，参考中国药典2015年版一部丹参含量测定条件，选择检测波长为286 nm。

3.3 流动相的选择试验分别采用乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）、乙腈-0.1%甲酸溶液（22∶78）作为流动相［12-15］进行比较研究。结果采用乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）为流动相，丹酚酸B 峰形较好，保留时间为21.1 min，N=12 085，分离度为9.5。

3.4 提取溶剂与提取时间的选择本试验分别对甲酸-水（1∶99）溶液、甲酸-甲醇-水（1∶80∶19）溶液和甲酸-甲醇（1∶99）溶液等溶剂［13-16］进行了考察，结果在甲酸-甲醇-水（1∶80∶19）溶液中溶解效果好，供试品溶液稳定，故选择甲酸-甲醇-水（1∶80∶19）溶液作为提取溶剂。并对超声时间进行比较考察，结果样品超声处理20 min 提取效率最高，因此供试品提取方法采用超声处理20 min。

4 结论

本研究首次建立了中药复方黄黛片中丹酚酸B含量测定的高效液相色谱法（HPLC）方法，该方法前处理简单，稳定准确，重现性好。所建立的定量测定方法与现有质量标准配合（丹参原儿茶醛定性鉴别），可以大幅度提升产品的质量控制水平，也为其质量标准的提高提供参考依据。