基于网络药理学和分子对接研究活络效灵丹治疗冠心病的分子机制

赵佳鑫，张娟利，马阳，黄少杰，陈海霞，牟菲，文爱东，*，丁一*（.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 7046；.空军军医大学第一附属医院药剂科，西安 7003）

冠状动脉粥样硬性化心脏病简称为“冠心病”（coronary heart disease，CHD），是由于冠状动脉硬化导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病。据《中国心血管健康与疾病2020》报告，自2018年以来，我国冠心病患者的死亡率快速增加，冠心病已经成为危害国人生命健康的重要疾病之一。

活络效灵丹出自于我国著名医家张锡纯的《医学衷中参西录》，是用于治疗气血凝滞、心腹疼痛的著名方剂。该方由四味中药组成，分别是丹参（

Salvia miltiorrhiza

Bge）、当归（

Angelica sinensis Oliv.

Diels）、乳香（

Boswellia carterii

Birdw）和没药（

Commiphora myrrha

Engl）。方中当归和丹参能活血祛瘀、凉血消痈又兼以养血；而乳香、没药可以活血行气、通经活络。四药配伍共同发挥活血通络，止痛祛瘀的功效。白幸华等利用丹参饮联合活络效灵丹加味治疗急性心肌梗死并发急性左心衰不仅取得了良好的治疗效果，而且无不良反应发生；杨德林在活络效灵丹的基础方剂上加味治疗冠心病解除了冠状动脉痉挛。活络效灵丹虽在临床中应用频繁，但其在治疗冠心病方面缺乏深入的研究，尤其是有效成分和作用机制尚不明确，需要进一步的研究。

随着生物信息学的发展，网络药理学已经成为研究中药的一种非常有效的科研方法，它可以系统、全面地揭示中药生物活性成分与其潜在作用机制之间的关系，因此，本研究采用网络药理学和分子对接的方法，探究活络效灵丹治疗冠心病的分子作用机制，为进一步的实验研究提供理论依据。

1 材料

1.1 试药与仪器

活络效灵丹（北京同仁堂，由丹参、当归、生明乳香、生明没药组成），GAPDH 抗体（批号：2118s，CST）；4%多聚甲醛组织固定液（批号：G1101）、PTGS2 抗体（批号：GB11077-1，GB11077-2）、HRP 标记的山羊抗兔IgG（批号：GB23303）（武汉塞维尔）。RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；NIKON ECLIPSE C1 正置荧光显微镜（日本尼康）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（批号：A020-2，南京建成）。

1.2 实验动物

雄性SD 大鼠40 只，购自空军军医大学实验动物中心[SCKX（军）字第2007-007 号]，体质量200 ～250 g，适应性饲养一周，期间自由饮水，12 h 循环光照，标准饲料喂养。

1.3 数据库、分析平台及软件

本研究使用的数据库、分析平台及软件信息见表1。

表1 数据库、分析平台及软件信息
Tab 1 Database，data analysis platform and software information

名称网址TCMSP 2.3https：//tcmspw.com/tcmsp.php GeneCardshttps：//www.genecards.org/DrugBankhttps：//go.drugbank.com/Uniprothttps：//www.uniprot.org/OMIMhttps：//omim.org/DisGeNEThttps：//www.disgenet.org/search DAVID 6.8https：//david.ncifcrf.gov/ImageGPhttp：//www.ehbio.com/ImageGP PDBhttps：//www.rcsb.org/STRINGhttps：//string-db.org/Cytoscape 3.7.1https：//cytoscape.org/

2 方法与结果

2.1 网络药理学研究

2.1.1 活络效灵丹活性成分筛选及相关靶点收集 在TCMSP2.3 数据库中分别以“丹参”“当归”“乳香”和“没药”为关键词检索四味中药的化学成分，以类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，上皮渗透性（Caco-2）≥－0.4 和药物半衰期（HL）≥4 为筛选条件并去重后获得活络效灵丹83 个有效成分，其中丹参48 个，当归2 个，乳香4 个和没药31 个。然后，通过TCMSP2.3收集靶点发现共有67 个有效成分有靶点（见表2），16 个有效成分未收到相关靶点，将所有靶点合并去重后使用Uniport 数据库转化为基因名称，共收集到216 个靶点。

表2 活络效灵丹中有靶点的67 个有效成分表
Tab 2 Information of 67 compounds with targets in Huoluo Xiaoling pill

No.化合物 ID成分名称OB 上皮渗透性 DLHL 来源药材1MOL001601 1，2，5，6-tetrahydrotanshinone38.750.960.36 18.05丹参2MOL001659 poriferasterol43.831.440.765.34丹参3MOL001771 poriferast-5-en-3beta-ol36.911.450.755.07丹参4MOL002222 sugiol36.111.140.28 14.62丹参5MOL002651 dehydrotanshinone Ⅱ A43.761.020.423.71丹参6MOL000006 luteolin36.160.190.25 15.94丹参7MOL007036 5，6-dihydroxy-7-isopropyl-1，1-dimethyl-2，3-dihydrophenanthren-4-one 33.771.190.29 14.91丹参8MOL007041 2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3，4-dione40.861.230.23 14.89丹参9MOL007045 3α-hydroxytanshinoneⅡa44.930.530.44 23.78丹参10 MOL007048（E）-3-[2-（3，4-dihydroxyphenyl）-7-hydroxy-benzofuran-4-yl]acrylic acid 48.240.180.318.87丹参11MOL007049 4-methylenemiltirone34.351.250.23 14.6丹参12 MOL007050 2-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-5-（3-hydroxypropyl）-7-methoxy-3-benzofurancarboxaldehyde 62.780.350.47.89丹参13 MOL007058 formyltanshinone73.440.540.42 24.12丹参14 MOL007059 3-beta-hydroxymethyllenetanshiquinone32.160.380.41 22.51丹参15 MOL007061 methylenetanshinquinone37.071.030.36 24.33丹参16 MOL007068 przewaquinone B62.240.390.41 24.94丹参17 MOL007069 przewaquinone c55.740.420.423.7丹参18 MOL007070（6S，7R）-6，7-dihydroxy-1，6-dimethyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-dione 41.31－0.060.45 22.54丹参19 MOL007071 przewaquinone f40.31－0.090.46 22.45丹参20 MOL007077 sclareol43.670.840.214.71丹参21 MOL007079 tanshinaldehyde52.470.570.45 23.49丹参22 MOL007081 danshenol B57.950.530.564.28丹参23 MOL007082 danshenol A56.970.330.525.15丹参24 MOL007085 salvilenone30.381.460.38 20.81丹参25 MOL007088 cryptotanshinone52.340.950.417.3丹参26 MOL007093 dan-shexinkum d38.880.670.55 30丹参27 MOL007094 danshenspiroketallactone50.430.880.31 15.19丹参28 MOL007098 deoxyneocryptotanshinone49.40.850.29 27.17丹参29 MOL007100 dihydrotanshinlactone38.681.260.325.42丹参30 MOL007101 dihydrotanshinoneⅠ45.040.950.36 18.32丹参31 MOL007108 isocryptotanshi-none54.980.930.39 31.92丹参

续表2

No.化合物 ID成分名称OB 上皮渗透性 DLHL 来源药材32MOL007111 isotanshinone Ⅱ49.921.030.424.73丹参33MOL007115 manool45.041.280.25.81丹参34MOL007119 miltionone Ⅰ49.680.350.32 41.49丹参35 MOL007122 miltirone38.761.230.25 14.82丹参36 MOL007124 neocryptotanshinone Ⅱ39.460.760.23 26.98丹参37 MOL007125 neocryptotanshinone52.490.350.32 14.46丹参38 MOL007127 1-methyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[5，6-g]benzofuran-6，10，11-trione34.720.50.37 37.89丹参39 MOL007130 prolithospermic acid64.370.10.318.82丹参40 MOL007150（6S）-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-quinone 75.390.030.46 23.45丹参41 MOL007151 tanshindiol B42.670.050.45 22.25丹参42 MOL007152 przewaquinone E42.85－0.040.45 22.44丹参43 MOL007154 tanshinone ⅡA49.891.050.423.56丹参44 MOL007155（6S）-6-（hydroxymethyl）-1，6-dimethyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-dione 65.260.440.45 23.48丹参45 MOL007156 tanshinone Ⅵ45.640.480.315.21丹参46 MOL000358 beta-sitosterol36.911.320.755.36 当归、没药47 MOL000449 stigmasterol43.831.440.765.57 当归、没药48 MOL001006 poriferasta-7，22E-dien-3beta-ol42.981.450.765.48没药49 MOL001013 mansumbinoic acid48.110.326.67没药50 MOL001022 11α-hydroxypregna-4，17（20）-trans-diene-3，16-dione36.620.820.474.53没药51 MOL001031 epimansumbinol61.811.360.44.71没药52 MOL001040（2R）-5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one42.360.380.21 16.83没药53 MOL001049 16-hydroperoxymansumbin-13（17）-en-3β-ol41.050.50.495.7没药54 MOL001052 mansumbin-13（17）-en-3，16-dione41.780.780.454.29没药55 MOL001061（16S，20R）-dihydroxydammar-24-en-3-one37.340.690.787.59没药56 MOL001062 15α-hydroxymansumbinone37.511.410.444.73没药57 MOL001063 28-acetoxy-15α-hydroxymansumbinone41.850.310.677.85没药58 MOL001095 isofouquierone40.950.950.788.48没药59MOL001126 [（5aS，8aR，9R）-8-oxo-9-（3，4，5-trimethoxyphenyl）-5，5a，6，9-tetrahydroisobenzofurano[6，5-f][1，3]benzodioxol-8a-yl] acetate 44.080.60.913.01没药60MOL001131 phellamurin_qt56.60.140.39 14.89没药61MOL001138（3R，20S）-3，20-dihydroxydammar-24-ene37.491.480.756.94没药62MOL001156 3-methoxyfuranoguaia-9-en-8-one35.151.040.187.97没药63 MOL000098 quercetin46.430.050.28 14.4没药64 MOL000988 4，17（20）-（cis）-pregnadiene-3，16-dione51.420.890.484.3没药65 MOL000996 guggulsterol Ⅳ33.590.930.744.83没药66 MOL001215 tirucallol42.121.380.756.9乳香67 MOL001241 O-acetyl-α-boswellic acid42.730.680.74.13乳香

2.1.2 冠心病靶点的获取 以“Coronary Heart Disease”为关键词分别在DisGeNET、DrugBank、GeneCards 和OMIM 数据库中搜索冠心病靶点。为了确保冠心病靶点的准确性，将DisGeNET 数据库的筛选条件设置为Score ≥0.3，GeneCards数据库设置relevance score ≥30。合并4 个数据库的检索结果并去重后得到695 个冠心病靶点。

2.1.3 共有靶点获取与PPI 网络构建 将216 个活络效灵丹的成分靶点与695 个冠心病靶点取交集获得50 个共有靶点。然后，将共有靶点导入STRING 数据库，物种设置为“人类”的同时设置“置信分数≥0.4”获得PPI 相互作用网络。将作用网络导入Cytoscape3.7.1 软件，利用cytoHubba插件计算排名前10 的hub 蛋白。结果显示hub 蛋白分别为：IL6、TNF、VEGFA、TP53、MMP9、PTGS2、ICAM1、CASP3、CCL2 和IL1

β

，见图1。

图1 共有靶点的PPI 网络图Fig 1 PPI network diagram of common targets

2.1.4 GO 生物富集分析与KEGG 通路富集分析 将共有靶点上传至DAVID6.8 数据库获取GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。选取

P

＜0.05 的分析结果并根据富集的基因数目进行可视化处理。获得了258 个生物学过程、23 个细胞成分以及37 个分子功能。选择GO 生物富集分析的10 条结果绘制柱状图见图2。结果显示活络效灵丹主要影响凋亡过程负调控，正向调节细胞增殖、炎症反应和应对缺氧等生物学过程；对细胞成分的影响主要在细胞质、生物质膜、线粒体、内质网膜等部位；通过与不同的酶结合，调控不同细胞因子活性等方面影响分子功能。通过KEGG 通路富集分析，获得76 条有效通路。主要涉及炎症反应、凋亡、缺氧反应等信号通路，提示活络效灵丹可能是通过这些通路发挥治疗冠心病的作用，前20 条通路气泡图，见图3。

图2 活络效灵丹GO 富集分析Fig 2 GO enrichment and analysis of Huoluo Xiaoling pill

图3 KEGG 通路富集分析结果前20 展示Fig 3 Top 20 pathways based on KEGG pathway enrichment analysis

2.1.5 构建“成分-靶点-通路”网络图 基于“2.1.3”项下的hub 蛋白逆向获得对应的有效成分，选取KEGG 富集的前20 条通路绘制“成分-靶点-通路”网络图。如图4 所示，通过对网络分析发现在靶点排序中Degree 值排序前5 的靶点分别是PTGS2、TNF、IL6、CASP3 和IL1

β

。在有效成分的Degree 值排序中前5 的有效成分分别是槲皮素、木犀草素、丹参酮ⅡA、

β

-谷甾醇和豆甾醇。提示这些成分与靶点可能是活络效灵丹治疗冠心病的重要成分与靶点。

图4 “成分-靶点-通路”图Fig 4 Component-target-pathway network

2.1.6 分子对接验证核心靶点与有效成分 根据“成分-靶点-通路”图筛选出的核心靶点PTGS2、TNF、IL6、CASP3、IL1

β

与核心成分槲皮素、木犀草素、丹参酮ⅡA、

β

-谷甾醇、豆甾醇进行两两对接。首先，从TCMSP2.3 数据库下载核心成分的结构并以mol2 格式保存。然后从RCSB（PDB）数据库下载核心靶点的配体结构，使用Autodock Vina 对接每个成分和配体。结合能＜－5 kcal·mol的对接分数表明该化合物与靶点之间具有良好的结合活性，结合能越低，说明结合活性越好。对接结果见表3，大部分靶点与有效成分具有较好的结合活性，提示网络药理预测的相关靶点具有较高的可靠性。将结合活性最强的前6 个成分靶点对接结果利用Discovery Studio 可视化，如图5 所示。

图5 分子对接结果可视化Fig 5 Visualization of molecular docking results

表3 活络效灵丹核心成分与关键靶点对接结果
Tab 3 Docking results of core components and key targets

靶点结合能/（kcal·mol－1）槲皮素木犀草素丹参酮ⅡAβ-谷甾醇豆甾醇曲美他嗪PTGS2-5KIR－8.5－8.4－8.2－2.9－5－6.9 IL6-4CNI－4－4.4－4.2－3.9－4.4－3.3 TNF-2AZ5－7.7－7.8－8.5－7.8－8.3－5.8 CASP3-3DEI－7.5－7.8－7.6－8.8－8.7－5.8 IL1β-5R88－6.7－7.3－7.1－7.1－7.2－5.4

2.2 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.3.0 软件进行统计学分析，计量资料使用均数±标准差表示，实验数据采用单因素方差分析法进行统计分析，

P

＜0.05 为差异具有统计学意义。

2.3 动物实验验证

2.3.1 大鼠心肌缺血模型建立 将SD 大鼠随机分为4 组，假手术组、模型组（等体积的生理盐水）、活络效灵丹高剂量组（5.4 g·kg）和低剂量组（2.7 g·kg），每组10 只，术后第1日开始给药，第7日末次给药2 h 后麻醉大鼠，腹主动脉取血并收集心脏组织。

分组完成后麻醉大鼠并连接12 导联心电图监测心率，经口无创插管连接呼吸机，对左胸进行消毒，打开左胸3、4 肋间隙，撕开心包膜，结扎左心耳下缘以下2 mm 处的左前降支（LAD），最后挤压胸腔内空气并逐层缝合。随后放入恒温箱中等待苏醒。假手术组大鼠只开胸，不结扎。

2.3.2 大鼠血浆LDH 测定 腹主动脉取血收集各组大鼠血液1 ～3 mL，3000 r·min离心20 min 后收集血浆，按照试剂盒步骤严格操作测定LDH 含量，结果见表4。

表4 大鼠血浆中LDH 含量(±s， ＝3)
Tab 4 Content of plasma LDH in rats of each group (± s， ＝3)

注：与假手术组相比， ＜0.01；与模型组相比， ＜0.05， ＜0.01。
Note：Compared with the sham operation group， ＜0.01；compared with the model group， ＜0.05， ＜0.01.

组别LDH/（U·L－1）假手术组1060±141.4模型组1906±209.5**活络效灵丹低剂量组1406±185.3#活络效灵丹高剂量组1072±94.67##

2.3.3 心肌组织组织病理学检查 取新鲜大鼠心脏组织用预冷的生理盐水反复冲洗后浸泡在4%多聚甲醛中固定24 h，随后石蜡包埋，制片，脱蜡至水，使用HE 染色和Masson 染色后，置于显微镜下观察心肌组织的病理学变化并采集图像，结果见图6，HE 染色结果显示假手术组的心肌组织结构排列紧密，细胞形态均匀，未见明显的心肌损伤；与假手术组相比，模型组心肌组织结构松散，肌纤维严重断裂，并伴有大量炎性细胞浸润和细胞间质水肿；活络效灵丹低剂量组心肌结构松散，中度炎性细胞浸润和间质水肿；活络效灵丹高剂量组心肌排列基本完整，少量炎性细胞浸润，未见明显的细胞间质水肿及少量纤维断裂，说明活络效灵丹可以不同程度的减轻心肌损伤与心肌炎症。

Masson 染色如图6 所示，假手术组的心肌组织排列紧密，细胞核形态表达正常，只有少量的纤维沉积；而模型组可见大量胶原沉积和纤维裂层，表明心肌纤维化程度非常严重；与模型组比较，活络效灵丹不同剂量组均能明显的减少胶原纤维的增生，改善心肌纤维化。

图6 各组大鼠心肌组织HE 染色与Masson 染色（×200）Fig 6 HE staining and Masson staining of the myocardial tissues of rats in each group（×200）

2.3.4 免疫荧光染色法 将心脏组织的石蜡切片脱蜡至水，切片放入抗原修复缓冲液中随后加入血清封闭30 min，切片与一抗于4℃下孵育过夜，TBST 洗涤3 次，每次5 min。随后与二抗室温避光孵育50 min；重复上述洗涤步骤后，封片，在荧光显微镜下观察并采集图像。免疫荧光切片和光密度测定结果如图7 所示，与假手术组相比，模型组大鼠心脏的PTGS2 蛋白荧光表达强度显著增强（

P

＜0.01）；与模型组相比，活络效灵丹低剂量组与高剂量组均能够显著降低PTGS2 蛋白的荧光表达强度（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。

图7 各组心肌组织的PTGS2 荧光染色与半定量分析（×400，n ＝3）Fig 7 PTGS2 fluorescence staining and semi-quantitative analysis in each group（×400，n ＝3）

2.3.5 蛋白免疫印迹法 取新鲜的心肌组织200 mg 加入2 mL 预制的蛋白裂解液置于冰上打碎匀浆，静置30 min 后，4℃、12 000 r·min离心15 min。取部分上清液BCA 蛋白法测定蛋白质浓度。其余上清液制成蛋白样品后，12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗（PTGS2）在4℃下孵育过夜，次日PVDF 膜洗涤3 次后加入二抗并在室温下孵育1 h，清洗PVDF膜3 次，采用ECL 法进行显色，使用化学发光成像系统（ChemiDOCTM XRS ＋，BIO-RAD）扫描图像。结果如图8 所示，模型组大鼠心肌组织中的PTGS2 蛋白表达量显著高于假手术组（

P

＜0.01）；与模型组相比，经活络效灵丹不同剂量组治疗后均能够有效降低PTGS2 的表达量，尤其是活络效灵丹高剂量组的治疗效果较为显著（

P

＜0.05）。

图8 各组大鼠心肌组织中的PTGS2 蛋白表达水平（n ＝3）Fig 8 Expression level of PTGS2 protein in the myocardial tissues of rats in each group（n ＝3）

3 讨论

本研究采用网络药理学对活络效灵丹防治冠心病的作用靶点和相关通路进行挖掘，探究其可能的分子机制。并通过PPI 网络分析和“成分-靶点-通路”图筛选出了活络效灵丹治疗冠心病的5个核心成分与5 个核心靶点。最后通过分子对接和动物实验对其药效和相关分子机制进行了初步验证。

通过“成分-靶点-通路”网络分析，提示槲皮素、木犀草素、丹参酮ⅡA、

β

-谷甾醇和豆甾醇等可能是活络效灵丹治疗冠心病的主要成分。何亚磊等通过建立缺血再灌注（MIRI）模型发现槲皮素可以降低大鼠的IL-6、TNF-

α

和IL-1

β

水平，提示槲皮素可以改善相关的炎症反应。研究发现木犀草素能够有效降低MIRI 大鼠的NF-

κ

B 表达，提示木犀草素可能通过NF-

κ

B 信号通路抑制炎症反应。丹参酮ⅡA 可以阻止I

κ

B磷酸化和NF-

κ

B 的激活，从而抑制炎症反应，减轻心肌细胞凋亡和纤维化过程；

β

-谷甾醇可以降低IL-1

β

、IL-6 和TNF-

α

的水平，抑制炎症反应；同时，

β

-谷甾醇可以通过PPAR

γ

/NF-

κ

B信号通路发挥对心肌的保护作用。豆甾醇与

β

-谷甾醇均为重要的植物甾醇，研究发现豆甾醇可以降低脂多糖（LPS）诱导的COX-2 和iNOS蛋白的表达。PPI 网络与“成分-靶点-通路”图表明PTGS2、TNF、IL-6、CASP3 和IL-1

β

具有较高的Degree 值，可能是活络效灵丹治疗冠心病的核心靶点。其中，PTGS2、TNF、IL-6 和IL-1

β

均与炎症过程密切相关，提示活络效灵丹可能主要通过抑制炎症反应发挥治疗冠心病的作用。PTGS2 也称为环氧合酶2（COX-2），主要存在于炎症细胞内，比如组织损伤的内皮细胞、成纤维细胞等，在各种炎症因子的刺激下，COX-2 会上调损伤部位的PGE2、PGI2 和TXA1 的含量，使炎症反应和组织损伤进一步加剧。Scheuren 等在实验中发现抑制COX-2 的表达后能减少心肌梗死面积，其机制是减少巨噬细胞在梗死区域和边缘的浸润，且能抑制心脏损伤部位的成纤维细胞增殖而减少心肌梗死。此外，抑制COX-2 表达还可以改善内皮依赖性血管舒张功能，减少冠心病的轻度慢性炎症和氧化应激水平。童静燕等通过大鼠MIRI 模型发现活络效灵丹给药组能够明显下调心肌组织中IL1-

β

、TNF-

α

和IL-6 的表达水平，降低心肌组织中的炎症水平，这一研究结果与预测的核心靶点相一致。根据GO 生物富集分析和KEGG 信号通路分析，发现活络效灵丹治疗冠心病的核心成分与靶点主要参与调控炎症反应信号通路，如TNF、NF-

κ

B 等关键的炎症信号相关通路，说明抑制炎症反应可能是治疗冠心病的主要通路之一。

基于网络药理学分析结果与分子对接结果，发现PTGS2 在“成分-靶点-通路”图中Degree值排名第一，与多个核心成分具有较好的结合活性，同时参与多条信号通路的调节，于是对核心蛋白PTGS2 进行了相关实验验证。研究证明活络效灵丹可以有效抑制心肌组织中PTGS2 的表达。此外，本研究还通过检验大鼠血浆LDH 含量，HE 染色与Masson 染色比对病理组织切片，发现活络效灵丹不同剂量组能不同程度地改善心肌缺血的病理学状态，明确了活络效灵丹对冠心病的治疗作用。

总之，本研究为之后活络效灵丹治疗冠心病的深入研究与临床研究提供了可靠的数据支持和探索方向。但是由于网络药理学研究的局限性，后续还需开展更加深入的研究。