miR-199a-5p、HIF-1a在甲状腺乳头状癌中的表达及其临床意义

马素刚，陈万军，王春艳，李 杨，孟明晨

(1.济南市章丘区人民医院甲状腺乳腺外科，山东 济南 250200；2.山东省肿瘤医院头颈外科，山东 济南 250117)

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最为常见的甲状腺恶性肿瘤，占80%以上[1]。尽管PTC手术治疗效果较好，然而一旦出现远处转移，会极大缩短患者的生存时间，5年生存率明显降低[2]。因此，寻找敏感的检测指标及预后评估指标对PTC患者手术方式的选择、临床治疗方案的制订、改善预后及降低病死率均有重要意义。近年来，微小RNA(microRNA,miRNA)在肿瘤相关疾病的研究中较为热门。miR-199a在多种肿瘤组织中呈异常表达，提示其与肿瘤的发生发展密切相关[3]。以往研究显示，miR-199a-5p在PTC细胞和组织中呈低表达[4]，缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在甲状腺癌组织中呈高表达[5]。基于此，本研究拟进一步探讨miR-199a-5p及HIF-1α在PTC组织中的表达及其临床意义，以期为PTC的临床治疗及新药开发提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2015年1月～12月我院收治的50例PTC患者为研究对象，收集患者手术切除的癌组织及癌旁组织。50例PTC患者中男11例，女39例；年龄38～70岁，平均(57.46±6.29)岁。纳入标准：①符合《甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南》[6]中PTC的诊断标准，并经术后病理确诊；②年龄18岁及以上；③术前未行放化疗及生物治疗；④临床资料完整。排除标准：①伴有结节性甲状腺肿；②伴有其他恶性肿瘤；③有内分泌疾病；④孕妇或哺乳期女性。本研究经济南市章丘区人民医院医学伦理委员会审核批准(EC20190802-1030)。

1.2 原位荧光杂交技术检测miR-199a-5p的表达

癌组织及癌旁组织样本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋并切片，室温保存待用。3%过氧化氢溶液室温灭活内源性过氧化物酶；暴露RNA核酸片段；滴加原位杂交试剂盒胃蛋白酶(博士德)预杂交，切片放入预杂交湿盒并滴加预杂交液进行杂交，加入miRNA buffer稀释地高辛，用以标记miR-199a-5p探针，盖玻片覆盖过夜；采用PBS清洗切片，滴加生物素化鼠抗地高辛，再次清洗后滴加生物素化过氧化物酶，DAB显色试剂盒显色，苏木素复染，酒精梯度脱水、透明，并在光学显微镜下观察。miR-199a-5p定位在肿瘤细胞胞浆则为阳性表达。

1.3 免疫组织化学法检测HIF-1α的表达

石蜡切片脱蜡、梯度脱水，柠檬酸钠抗原修复，3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶，BSA封闭，一抗、二抗孵育，DAB显色，苏木素复染，脱水封片，在光学显微镜下进行观察。由两位不清楚患者状况的病理科专家独立阅片及评分，取平均值，若分歧过大则请另一位专家参评。染色呈棕黄色或黄褐色细小颗粒则为阳性。染色强度计分标准：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；染色阳性细胞率记分标准：随机选取4个高倍镜视野进行观察，记录阳性细胞率，低于1%为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，80%以上为4分。采用免疫反应评分系统，即染色强度得分与阳性细胞率得分的乘积则为综合得分，综合得分≥4分为阳性表达。

1.4 观察指标

收集患者的性别、年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期等资料。所有患者术后均随访12～60个月，平均(53.70±4.25)个月，无失访病例。生存时间为术后至2020年12月，或至死亡、复发等不良预后的时间。

1.5 统计学方法

使用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计数资料以率(%)表示，采用χ2检验分析miR-199a-5p及HIF-1α表达情况与临床特征的关系；采用Cox回归分析影响患者预后的危险因素；采用Spearman相关系数分析miR-199a-5p与HIF-1α表达的相关性；采用Kaplan-Meier生存曲线分析患者的5年生存率。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织及癌旁组织中miR-199a-5p、HIF-1α的表达

癌组织中miR-199a-5p的阳性表达率为22.00%(11/50)，显著低于癌旁组织的52.00%(26/50)，差异有统计学意义(χ2=14.263，P=0.000)。癌组织中HIF-1α的阳性表达率为58.00%(29/50)，显著高于癌旁组织的16.00%(8/50)，差异有统计学意义(χ2=17.451，P=0.000)，见图1。

2.2 miR-199a-5p、HIF-1α表达与临床特征的关系

不同性别、年龄患者癌组织中miR-199a-5p、HIF-1α的表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；肿瘤直径≥4 cm、淋巴结转移及TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的患者癌组织中miR-199a-5p阴性表达率及HIF-1α阳性表达率均明显高于肿瘤直径<4 cm、无淋巴结转移及TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者(P<0.05)，见表1。

a：miR-199a-5p(原位荧光杂交，×100)；b：HIF-1α(免疫组化染色，×200)

临床特征nmiR-199a-5p阳性表达阴性表达χ2PHIF-1α阳性表达阴性表达χ2P性别男112(18.18)9(81.82)1.0470.3896(54.55)5(45.45)0.8430.562女399(23.08)30(76.92)23(58.97)16(41.03)年龄<60岁205(25.00)16(80.00)0.9860.42212(60.00)8(40.00)1.0120.403≥60岁306(12.00)23(76.67)17(56.67)13(43.33)肿瘤直径<4 cm4310(23.26)33(76.74)10.9720.00023(53.49)20(46.51)13.6580.000≥4 cm71(14.29)6(85.71)6(85.71)1(14.29)淋巴结转移无299(31.03)20(68.97)11.7530.00011(37.93)18(62.07)15.3050.000有212(9.52) 19(90.48)18(85.71)3(14.29)TNM分期Ⅰ～Ⅱ期329(28.13)23(71.88)9.6280.00414(43.75)18(56.25)11.6920.000Ⅲ～Ⅳ期182(11.11)16(88.89)15(83.33)3(16.67)

2.3 患者预后的危险因素

以miR-199a-5p(0=阳性表达，1=阴性表达)、HIF-1α(0=阴性表达，1=阳性表达)、淋巴结转移(0=无，1=有)、TNM分期(0=Ⅰ～Ⅱ期，1=Ⅲ～Ⅳ期)为自变量，以患者的预后为因变量进行Cox回归分析，结果显示，miR-199a-5p阴性表达、HIF-1α阳性表达、淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期是影响患者预后的独立危险因素(P<0.05)，见表2。

表2 Cox回归分析影响患者预后的危险因素

2.4 危险因素之间的相关性分析

Spearman相关系数分析显示，患者肿瘤直径、淋巴结转移及TNM分期之间无明显相关性(P>0.05)；癌组织中miR-199a-5p表达与HIF-1α表达呈明显负相关(r=-0.795，P=0.000)，见图2。

图2 患者癌组织中miR-199a-5p表达与HIF-1α表达的相关性

2.5 患者的生存分析

在随访期间，50例患者中有43例存活，7例死亡，存活率为86.00%。miR-199a-5p阳性表达患者的5年生存率为100%(11/11)，明显高于miR-199a-5p阴性表达患者的82.05%(32/39)，差异有统计学意义(P<0.05)；HIF-1α阴性表达患者的5年生存率为95.24%(20/21)，明显高于HIF-1α阳性表达患者的79.31%(23/29)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

a：miR-199a-5p；b：HIF-1α

3 讨论

PTC在临床上较常见，其发生受激素、遗传、环境等因素的影响。近年来，PTC的发病率呈逐年增加趋势，严重影响患者的生活质量。因此，早期识别PTC及评估预后对患者具有重要意义。但影响PTC患者预后的因素较多，且目前尚无公认的PTC早期筛查及预后评估指标。

本研究中与癌旁组织比较，癌组织中miR-199a-5p的阴性表达率及HIF-1α的阳性表达率明显增高，提示在PTC组织中miR-199a-5p低表达，HIF-1α高表达。HIF-1α是Snai1的转录因子，以往研究显示，PTC组织中miR-199a-5p表达明显下调，Snai1表达明显上调，miR-199a-5p过表达和Snai1敲低可在体外抑制PTC细胞的增殖，使细胞侵袭性降低，上皮间充质转化减少[4，7]。曾勇等[8]的研究显示，HIF-1α在甲状腺癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织；肖小琴等[9]的研究显示，PTC组织中HIF-1α蛋白表达上调。由此推测，在PTC的进展过程中，miR-199a-5p低表达使其靶基因HIF-1α高转录，从而促进细胞上皮间充质转化进程，提示miR-199a-5p/HIF-1α可能成为PTC的诊疗靶点。

本研究结果显示，miR-199a-5p阴性表达、HIF-1α阳性表达与肿瘤直径≥4 cm、淋巴结转移及TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期有关，miR-199a-5p与HIF-1α的表达呈明显负相关。Wang等[10]的研究显示，沉默长链非编码RNA烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA 1通过上调miR-199a-5p促进PTC细胞凋亡；董斌[11]的研究显示，HIF-1α在PTC组织中的阳性表达率增高，且与TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)、淋巴结转移有关，本研究结果与之基本一致。miR-199a-5p在多种肿瘤组织中呈异常表达，提示miR-199a与肿瘤的发生发展密切相关[12-13]。miR-199a的两种成熟体miR-199a-3p和miR-199a-5p在多种肿瘤中有不同的靶基因，发挥不同的调控功能。miR-199a-5p主要调节细胞的增殖、凋亡[14]。HIF-1α是具有转录活性的核蛋白，靶基因谱非常广泛，包括与缺氧适应、炎症发展及肿瘤生长等相关的近百种靶基因[15]。有研究发现，过表达miR-199a-5p可下调HIF-1α的表达，从而抑制黑色素瘤细胞的增殖，使细胞停留在G1期[16]；同时也有研究证实，过表达miR-199a-5p能显著抑制肝癌的发展速度[17]；此外，还有研究发现，miR-199a-5p可通过靶向结合HIF-1α mRNA的3’-UTR，调控HIF-1α基因参与的信号通路中相关分子的表达，从而抑制前列腺癌细胞的生长、增殖，并诱导细胞凋亡[18]。RNA测序分析及细胞实验发现，miR-199家族对头颈部鳞状细胞癌细胞的侵袭、迁移具有明显的抑制作用[19]。以上研究表明，miR-199a-5p可对HIF-1α进行负性靶向调控，可能是miR-199a-5p/HIF-1α调控PTC细胞增殖、迁移等过程的机制之一，但具体机制还需进一步研究。

本研究还发现，miR-199a-5p阴性表达、HIF-1α阳性表达、淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期是影响PTC患者预后的独立危险因素；miR-199a-5p阳性表达患者的5年生存率明显高于阴性表达患者，HIF-1α阴性表达患者的5年生存率明显高于阳性表达患者。这提示miR-199a-5p可能是一种抑癌基因，miR-199a-5p低表达上调HIF-1α的表达，促进肿瘤细胞上皮间充质转化进程，增加肿瘤细胞的侵袭及迁移，使得临床分期较晚，促进疾病进展，导致患者预后不良，生存率降低[20-21]。因此，miR-199a-5p/HIF-1α可以作为PTC早期识别及预后评估的生物标志物。

综上所述，PTC组织中miR-199a-5p低表达，HIF-1α高表达，且二者表达呈负相关，并与临床特征及5年生存率密切相关，是影响患者预后的危险因素。但miR-199a-5p/HIF-1α在PTC细胞的增殖、侵袭、迁移等过程中的具体机制还需进一步研究。