ADAMTS14在肾透明细胞癌中的表达和作用机制

黄 尉，韩均凌，沈宏峰

(1.解放军联勤保障部队928医院泌尿外科，海南 海口 570206；2.解放军联勤保障部队928医院消化内科，海南 海口 570206)

肾细胞癌是常见的泌尿系恶性肿瘤，发病率仅次于膀胱癌，且其发病率和病死率逐年上升[1]。肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是肾细胞癌最常见的病理亚型，占70%～85%[2]。早期ccRCC患者主要依赖手术治疗，而对于晚期ccRCC患者而言，治疗方式的选择十分有限[3-4]。靶向治疗是目前晚期ccRCC患者的主要治疗方式之一，但由于存在毒副作用以及耐药性，多数患者的预后仍较差[4-5]。因此，寻找新型靶向生物标记物及潜在的治疗靶点对于改善晚期ccRCC患者的预后具有十分重要的意义。

Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶14(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 14,ADAMTS14)定位于10q22.1区域，具有25个外显子区域。该基因主要编码ADAMTS蛋白，ADAMTS蛋白可催化细胞外基质中的多种底物[6]。有研究显示，ADAMTS14与血液凝固、动脉粥样硬化、伤口愈合、血管生成、生育能力、关节炎和癌症等病理生理过程相关[7]。近年来，多项研究在多种人类恶性肿瘤中发现ADAMTS14异常表达。Lin等[8]发现ADAMTS14在口腔癌组织中低表达，且ADAMTS14的低表达与患者较高的淋巴结转移率、更晚期的临床分期和较差的预后显著相关。Su等[9]发现ADAMTS14基因多态性和环境诱变剂之间的相互作用是口腔癌发生的危险因素，且ADAMTS14的非同义单核苷酸多态性rs12774070与口腔癌细胞分化程度有关。Sheu等[10]研究发现ADAMTS14的非同义单核苷酸多态性(rs12774070和rs61573157)参与肝细胞癌的发生发展。此外，Song等[11]发现ADAMTS14可通过调节microRNA-572/钙调神经磷酸酶1调节剂抑制肝细胞癌进展。ADAMTS14在多种恶性肿瘤中具有致癌潜力，但目前尚未见其在ccRCC中的相关报道。基于此，本研究通过生物信息学技术对肿瘤学数据资源进行二次分析，探索ADAMTS14与ccRCC的相关性，以期为后续实验研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 TIMER数据库

TIMER数据库是一个可以系统分析不同癌症类型中免疫细胞浸润的综合数据库[12]，其“DiffExp”模块可以分析任何基因在TCGA所有肿瘤组织和正常组织之间的表达差异。本研究首先通过TIMER数据库分析ADAMTS14在33种恶性肿瘤中的表达。

1.2 TCGA和ICGC数据库

TCGA可通过大规模高通量测序分析技术创建全面的癌症基因组图谱[13]。本研究从该数据库中获取了72个正常肾组织样本和530个ccRCC组织样本的RNA测序数据，以及530例ccRCC患者的临床资料(表1)。此外，本研究从ICGC数据库[14]中获得了45个正常肾组织样本和91个ccRCC组织样本的RNA测序数据。

1.3 GEPIA和Kaplan-Meier Plotter数据库

GEPIA数据库包含来自TCGA和GTEx项目的9 736个肿瘤样本和8 587个正常样本的RNA测序表达数据[15]。其“survival”模块可以根据基因表达进行总生存率或无病生存率分析。Kaplan-Meier Plotter数据库能够评估54 000多个基因对21种癌症生存预后的影响，该工具的主要目的为发现和验证肿瘤预后生物标记物[16]。本研究采用以上2个数据库进一步分析ADAMTS14对ccRCC患者生存预后的影响。

表1 TCGA数据库中ccRCC患者的临床资料

1.4 ADAMTS14高低表达组之间的差异表达基因和功能分析

为了探索ADAMTS14在ccRCC中的潜在作用机制，本研究获取了ADAMTS14高低表达亚组之间的差异基因。根据ADAMTS14的表达中位值，将530例患者分为高表达组和低表达组，采用R语言的“limma”包进行差异表达分析[17]，错误发现率小于0.05且logFC绝对值大于1(变化倍数为2倍)的基因被视为2组的差异表达基因，通过R语言的“clusterProfiler”程序包对这些差异表达基因进行功能注释和通路富集分析[18]。

1.5 统计学分析

采用R 3.6.1软件进行统计学分析，使用Wilcoxon符号秩和检验比较ccRCC组织和正常肾组织中ADAMTS14的表达差异，采用Kaplan-Meier生存曲线评估ADAMTS14表达对ccRCC患者生存预后的影响，采用Wilcoxon符号秩和检验或Kruskal-Wallis检验和χ2检验或Fisher确切概率法探讨ccRCC患者临床病理变量与ADAMTS14表达水平的关系。通过单变量和多变量Cox回归分析确定独立预后因素和临床变量。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ADAMTS14在泛癌中的表达

TIMER数据库分析结果显示，与正常组织相比，ADAMTS14在乳腺浸润癌、胆管癌、结肠癌、食管癌、头颈鳞状细胞癌、ccRCC、肾乳头状细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞癌、直肠腺癌、胃癌、甲状腺癌以及子宫内膜癌中显著高表达(P<0.001)，见图1a。

2.2 ADAMTS14在ccRCC中的表达验证

TCGA数据库的mRNA数据分析显示，与正常肾组织相比，ADAMTS14在ccRCC组织中显著高表达(P<0.001)，见图1b。ICGC数据库分析结果显示，与正常肾组织相比，ADAMTS14在ccRCC组织中显著高表达(P<0.001)，见图1c。

2.3 ADAMTS14表达与ccRCC患者临床病理特征的相关性

ADAMTS14与患者的组织学分级、临床分期以及TNM分期有关，随着ADAMTS14的上调，组织学分级、临床分期以及TNM分期越高，见图2、表2。

a:ADAMTS14在泛癌中的表达(TIMER数据库)；b:ADAMTS14在正常肾组织及ccRCC组织中的表达(TCGA数据库)；c:ADAMTS14在正常肾组织及ccRCC组织中的表达(ICGC数据库) ***:与正常组织比较，P<0.001

a:临床分期;b:组织学分级;c:T分期;d:N分期;e:M分期

表2 ADAMTS14表达水平与ccRCC患者临床病理特征的关系[例(%)]

2.4 ADAMTS14表达对ccRCC患者预后的影响

ADAMTS14高表达的患者总体生存率明显低于低表达的患者(图3a)。Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果亦显示，ADAMTS14表达水平越高，患者总体生存率越低(图3b)。GEPIA数据库分析结果显示，ADAMTS14高表达与患者较低的总体生存率和无病生存率显著相关(图3c、d)。

2.5 独立预后因素和临床变量的鉴定

ADAMTS14高表达是ccRCC患者总体生存率较低的独立预后因素(HR=1.179,P<0.05)；年龄较大也是ccRCC患者的独立预后因素(HR=1.034,P<0.05)，见表3。

表3 单变量和多变量Cox回归分析

2.6 ADAMTS14在ccRCC中的潜在作用机制

基于错误发现率小于0.05且logFC绝对值大于1(变化倍数为2倍)的条件，本研究从ADAMTS14高低表达中鉴定出了1 230个差异表达基因。图4a、b分别为差异表达基因的热图和火山图。GO功能注释和KEGG通路富集分析结果显示，这些差异表达基因富集在细胞外基质及其受体的相互作用、细胞因子及其受体的相互作用、PI3K-Akt信号通路和IL-17信号通路等已知的癌症相关生物学过程和通路中(图5)。

a～b:ADAMTS14表达对患者总体生存率的影响(TCGA数据库，Kaplan-Meier Plotter数据库)；c～d:ADAMTS14表达对患者总体生存率和无病生存率的影响(GEPIA数据库)

a：热图；b：火山图

a:GO功能注释；b:KEGG通路富集分析

3 讨论

ccRCC是高度异质性的泌尿系恶性肿瘤，其发生发展的生物学机制目前尚不完全清楚。靶向治疗是晚期ccRCC患者的主要治疗方式，但研究表明仅有20%～40%的患者从中获益，多数高危患者的预后仍较差。探索新型生物标记物及其潜在的作用机制，对于理解ccRCC的发病机制以及改善患者预后有重要意义。因此，本研究基于生物信息学探索ADAMTS14作为ccRCC潜在治疗靶点的可能性。

本研究结果显示，ADAMTS14在多种人类恶性肿瘤中高表达，其在ccRCC组织中也呈上调趋势；临床病理相关性分析显示，随着ADAMTS14表达的升高，ccRCC患者的组织学分级、临床分期、TNM分期越高；生存分析显示，ADAMTS14高表达与患者较低的总体生存率和无病生存率相关；单变量和多变量Cox分析结果显示，ADAMTS14高表达是ccRCC患者总体生存率较低的独立预后因素。基于以上结果，本研究推测，ADAMTS14可能是ccRCC的潜在促癌因子，有望成为ccRCC的潜在预后生物标记物。

为了探索ADAMTS14在ccRCC中的潜在作用机制，本研究获取了ADAMTS14高低表达组之间的差异表达基因，对其进行功能分析发现，这些差异表达基因富集在经典的肿瘤信号通路，如细胞外基质及其受体的相互作用、细胞因子及其受体的相互作用、PI3K-Akt信号通路和IL-17信号通路，而这些信号通路被证实在癌症中具有关键的调节作用。细胞外基质由结构和功能复杂的大分子混合物组成，在组织器官的形态发生以及组织细胞的结构和功能维持上发挥着重要作用。细胞外基质及其受体相互作用，从而可实现对细胞活动的直接或间接控制，如黏附、迁移、分化、增殖及凋亡。有研究证实，细胞外基质及其受体相互作用的失调与多种癌症的进展有关[19]。细胞因子及其受体的相互作用在先天性免疫和抗肿瘤免疫过程中发挥着重要作用，细胞因子的信号转导被证实在肿瘤进程中扮演重要角色[20]。PI3K-Akt信号通路是经典的肿瘤信号相关通路，其可被多种类型的细胞损伤激活，进一步调节基本的细胞功能，如转录、翻译、增殖、生长和存活[21]。由于PI3K-Akt信号通路在癌症发生发展中的作用，靶向该信号通路的药物研发也引起了人们的关注。正常生理状态下，IL-17信号通路主要在保护宿主免受细胞外病原体侵害等方面发挥作用；病理状态下，IL-17信号通路的异常激活与肿瘤免疫密切相关，具体表现为：IL-17是Th17衍生的细胞因子，可以通过直接促进转化细胞特性和邻近基质细胞活性来影响肿瘤微环境；此外，IL-17还可通过调节骨髓细胞和T细胞的活性参与免疫系统的调节[22]。结合本研究以上结果和相关文献，推测ADAMTS14可能通过IL-17信号通路参与ccRCC的进程。

综上所述，ADAMTS14具有作为ccRCC预后生物标记物和治疗靶点的潜力，ADAMTS14潜在调控信号通路是理解ccRCC发病机理的突破点。但本研究也存在局限性，缺乏ccRCC中ADAMTS14蛋白水平的证据，且ADAMTS14影响ccRCC患者预后的确切机制尚未完全阐明，有待进一步研究以验证该结论。