人卵丘颗粒细胞ADAMTS-1、GDF-9表达水平与IVF胚胎学结局的相关性分析

许相洋,黄 煌,林迳苍，杜冰汝

(1.泉州医学高等专科学校基础医学部，福建 泉州 362000；2.泉州医学高等专科学校附属人民医院病理科,福建 泉州 362000)

体外受精—胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF)过程中，受精的质量以及早期的胚胎质量是影响患者妊娠效果的重要因素[1]。Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motifs，ADAMTS-1)是人卵泡颗粒细胞及人卵丘颗粒细胞重要的蛋白水解酶，但以往研究主要集中于动物实验，人体研究较少[2]。ADAMTS-1可通过对患者的多功能蛋白聚糖、短蛋白聚糖以及聚集蛋白聚糖产生降解作用，造成蛋白聚糖的结节，导致卵泡壁破溃[3]。生长分化因子-9(growth differentiation factor-9，GDF-9)是由卵母细胞分泌，属于卵源性生长因子，也是卵泡发育的重要调节因子。有效分析IVF胚胎学结局的影响因素，并给予针对性措施进行干预，具有十分重要的临床价值，但目前临床人卵丘颗粒细胞ADAMTS-1、GDF-9表达水平与IVF胚胎学结局的相关性仍处在探索阶段，本研究主要通过分析人卵丘颗粒细胞ADAMTS-1、GDF-9表达水平与IVF胚胎学结局的相关性，为临床不孕症的诊断以及早期干预提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

采用前瞻性研究方法，将2017年1月至2021年1月于泉州医学高等专科学校附属人民医院诊断并进行IVF治疗的120例不孕症患者作为观察组，年龄21～35岁，平均(28.12±2.11)岁，BMI为(24.55±3.43)kg/m2，根据妊娠结局将其分为妊娠成功组(75例)和妊娠失败组(45例)；另选取120例同期进行健康体检的女性作为对照组，年龄21～36岁，平均(28.09±3.52)岁，BMI为(24.66±1.33)kg/m2。观察组与对照组患者的年龄、BMI比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经泉州医学高等专科学校附属人民医院医学伦理委员会审核批准(LLH20160611)，所有研究对象均签署知情同意书。

观察组患者纳入标准：①首次进行IVF治疗；②年龄<35岁；③基础卵泡刺激素<10 IU/L；④窦卵泡数>5个；⑤获卵数>15个。排除标准：①不宜接受排卵治疗；②有高泌乳素血症；③高雄性激素分泌。

1.2 方法

IVF治疗：患者于月经后2～4 d注射50～100 mg/d克罗米芬，5 d后采用150 IU/d尿促卵泡素和50 mg/d克罗米芬至扳机日，按照血中促黄体生成素(luteotropic hormone，LH)、卵泡直径、雌孕激素等水平和状态确定干预时间，当有1个卵泡直径≥18 mm、有2个卵泡直径≥17 mm或有3个卵泡直径≥16 mm时，给予曲普瑞林干预，32～34 h后取卵，依照精液参数行常规IVF干预并进行体外受精，评估胚胎质量后进行移植。

采集所有患者的卵泡液，室温下将患者的卵泡液以2 500 r/min离心10 min，弃去上清液，将细胞沉积重悬于磷酸缓冲盐溶液中，使用1∶1的细胞悬浮液悬浮于Ficoll分离液中，再次以2 500 r/min离心10 min，抽取两液面之间的颗粒细胞层，加入5倍体积的磷酸缓冲盐溶液，再次以2 500 r/min离心20 min，弃去上清液，在1 mL 0.1%透明质酸酶中充分震荡及消化，使用2倍体积的10%胎牛血清终止消化，离心后弃去上清液，参照文献[4]制备颗粒细胞。

采用Western blot对以上细胞液中相关蛋白水平进行检测，使用细胞刮刀收集细胞，将收集的细胞放在冰上裂解30 min，充分裂解后，再次以2 500 r/min离心10 min，取上清液，采用SDS-PAGE以120 V恒压进行电泳，检测卵泡液中的ADAMTS-1以及GDF-9水平。

1.3 观察指标

比较观察组和对照组ADAMTS-1、GDF-9表达水平；比较不同IVF胚胎学结局患者ADAMTS-1、GDF-9表达水平。联合检测评估不良结局，计算灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值，灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%，特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%，阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)，阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 ADAMTS-1、GDF-9表达水平比较

观察组的ADAMTS-1、GDF-9表达水平显著低于对照组(P<0.05)，见表1。妊娠成功组的ADAMTS-1、GDF-9表达水平显著高于妊娠失败组(P<0.05)，见表2。

表1 观察组和对照组ADAMTS-1、GDF-9表达水平比较

表2 不同IVF胚胎学结局患者的ADAMTS-1、GDF-9表达水平比较

2.2 相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，患者的IVF胚胎学结局与ADAMTS-1、GDF-9表达水平呈正相关，见表3。

表3 相关性分析

2.3 联合检测效能分析

ADAMTS-1、GDF-9表达水平的联合检测特异度高于单独检测，见表4。

表4 联合检测效能分析

2.4 ROC曲线分析

ADAMTS-1、GDF-9表达水平联合检测的AUC显著高于单独检测，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表5。针对妊娠失败患者，ADAMTS-1、GDF-9的临界值分别为0.3及0.15。

表5 ROC曲线分析

3 讨论

IVF的关键步骤在于获取合适的优质卵子及胚胎，随着辅助生殖技术的日益发展和促排卵方案的日臻成熟，如何根据卵巢储备功能选择合适的促排卵方案成为了临床医生必须面对的关键问题[5]。而在实际的IVF治疗中，患者的宫颈机能不全极易造成流产以及早产。所以在对患者的IVF治疗中及时对其不良预后的风险进行评估，及早开展干预，对于患者的妊娠具有积极的意义[6]。

ADAMTS-1主要位于人体的21号染色体中[7]，有研究发现，ADAMTS-1与细胞外基质的生理功能显著相关，是机体排卵以及受精过程中的重要关键水解蛋白酶[8]。动物研究结果显示，将实验小鼠的ADAMTS-1基因进行靶向破坏敲除后，小鼠卵巢功能会发生障碍[9]。目前临床对于ADAMTS-1的研究仅仅局限在动物研究中，对于人体的研究较少[10]。理论研究认为，ADAMTS-1可通过对蛋白聚糖的裂解作用进一步对排卵前卵泡以及卵母细胞复合物的细胞结构与形态进行调控[11]。本研究结果显示，采用IVT治疗的不孕症患者ADAMTS-1表达水平显著低于正常人群，妊娠成功患者的ADAMTS-1表达水平显著高于妊娠失败患者。妊娠失败患者卵丘—卵母细胞复合体在输卵管运输时间的延长，进一步抑制了ADAMTS-1的表达，导致ADAMTS-1表达水平明显下降[12-13]。纪艺珍等[14]通过对采用IVT治疗的患者的ADAMTS-1表达水平进行分析发现，随着患者妊娠结局变差，其ADAMTS-1表达水平呈显著下降趋势，本研究结果与之一致。

GDF-9的异常表达影响着卵巢中卵泡的发育，体外实验已经证实，GDF-9可造成大量的始基卵泡生长启动，进一步降低卵泡闭锁，促进患者卵泡存活以及生长发育，同时，其通过对患者垂体激素的显著激活作用，可进一步促进患者颗粒细胞分泌因子的分泌，进而促进患者的卵泡发育[15]。在卵巢体细胞的发育过程中，GDF-9对于卵巢功能的维持具有显著作用，同时，其还可通过卵母细胞的直接作用对卵巢功能进行调节。李春燕等[16]通过对患者的GDF-9水平与卵巢功能进行分析发现，患者的卵巢功能与GDF-9呈现明显相关性，本研究与之互为印证。

本研究对患者的联合检测效能进行比较发现，ADAMTS-1、GDF-9对于早期妊娠结局的预测具有重要的作用，而通过ROC曲线得到的临界值对于临床早期预测不良妊娠结局具有重要意义。

综上所述，人卵丘颗粒细胞ADAMTS-1、GDF-9表达水平与IVF胚胎学结局呈显著相关性，可作为临床诊断的重要依据。