增强MRI肝癌成像中转运蛋白OATP1B3表达及其临床亚类分析

有研究表明采用分子靶向药物治疗中晚期肝细胞癌(HCC)对患者的临床结局有益，提示了分子靶向治疗HCC的潜力

。HCC的分子发病机制复杂，既往研究已发现几个信号级联(如p53、Wnt/β-catenin和表皮生长因子受体)的异常与之有关

。采用全基因组分析可对肝癌患者进行分子分类，但存在取样偏差等局限

。因此，需要探究一种更实用的方法来对HCC分子亚型进行分类，有助于HCC分子靶向药物的使用选择。

诊断HCC的影像学方法包括超声、计算机断层扫描和磁共振成像(MRI)。相对于背景肝脏，大多数肝细胞癌在钆塞酸增强MRI(EOB-MRI)的肝胆期图像中表现出低强度，而在某些肝癌表现出中等强度或高强度

。已有研究对HCC中Gd-EOB-DTPA的转运体进行了研究，发现有机阴离子转运多肽1B3(OATP1B3)是其中一种转运体

。EOB-MRI可提供有关HCC的分子信息，并有可能区分HCC的特定分子亚型。因此本研究拟探索HCC中Gd-EOB-DTPA的主要转运蛋白 OATP1B3的mRNA和蛋白质表达水平，并利用其进行HCC临床亚类分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年4月至2017年12月在本院接受手术治疗的73例HCC患者(101个结节)为研究对象。其中男59例，女14例；平均年龄(67.4±10.1)岁；病因：乙型肝炎病毒感染者29例，丙型肝炎病毒感染者25例，酒精性肝病者9例，非酒精性脂肪性肝病者3例，不明原因者7例；肝纤维化0～2期者36例，3～4期者37例。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①术前进行EOB-MRI检查；②年龄>18岁；③签署书面知情同意书，随访期为2年；④本研究通过本院伦理审查委员会的批准。排除标准：①肝脏大面积坏死；②有肝脏手术或介入治疗史者。

⑨姚贤镐：《中国近代对外贸易史资料(1840-1895)》，第二册，中华书局1962年版，第800-801页.

1.3 研究方法

2.2 OATP1B3的表达与临床病理特征关系 在纳入的14例局部复发性肿瘤结节中和具有多结节融合生长的结节中均未显示OATP1B3的表达。肿瘤胆汁淤积与OATP1B3表达呈显著相关性(

=0.005)。见表3。

1.3.2 实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR) 对其中34例患者(5例分化良好，23例中分化，6例低分化)的34份冷冻样本进行qRT-PCR分析。对6个ATP结合盒(ABC)和6个溶质载体家族(SLC)转运蛋白进行分析。

1.3.6 EOB-MRI中肿瘤增强的临床病理特征 采用免疫组化中的GS弥漫性强表达作为Wnt/β-catenin激活HCC的标志物。采用接收者操作特征曲线(ROC)确定Wnt /β-catenin激活的HCC的最佳RER临界值，使用该临界值计算灵敏度、特异性和准确性。比较采用该临界值分类的高和低RER结节患者的病理特征。Kaplan-Meier事件发生时间曲线用于估计总体生存率(OS)和无复发生存率(RFS)。

根据EOB-MRI时RER临界值将73例患者的101个结节分为两组(RER≥0.9和RER<0.9)时，发现肿瘤增强与OATP1B3表达评分和GS弥漫性强表达呈显著相关性，见表7。

2.3 与OATP1B3表达的关联分析 将结节分为OATP1B3阳性表达组(相对表达水平≥0.018，

=14)和OATP1B3阴性表达组(相对表达水平<0.018，

=20)。分析了12个基因的mRNA表达水平，其中CYP2E1，GS，OAT，AXIN2，和LGR5(与Wnt/β-catenin信号传导有关)在OATP1B3阳性表达组中显著增高(

<0.001)。见表4。

研究表明，不同国家、不同时期的胰腺炎病因谱存在一定的差异。在我国胰腺炎的主要病因为胆道系统疾病，而在欧美及西方发达国家则以饮酒和暴饮暴食为主要病因。鉴于此，本研究应用时间序列分析方法探讨改革开放30年来尤其是近20年山东聊城市人民医院收治的急性胰腺炎(AP)患者的病因，为该地区胰腺炎的预防和治疗提供决策支持。

1.3.5 细胞培养和体外实验 采用人Wnt靶基因表达低的HCC细胞系KYN-2进行实验。KYN-2细胞在补充有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基中在37℃、5%CO

培养箱中培养。传代2次后将细胞接种于6孔板中温育1 d，然后用5 mmol/L或10 mmol/L LiCl处理。加入LiCl 2 d后，收集细胞提取总RNA。采用TCF荧光素酶报告系统测量Wnt信号活性。

本流域属亚热带气候，高温湿润多雨，具有明显的干湿季节。东江流域多年平均降水量在1 500 mm～2 400 mm之间，其中4月—9月占全年降雨的80%以上。东江洪水具有水情复杂、洪水遭遇种类繁多等特点。由锋面雨造成的洪水峰型较肥硕，涨水缓慢。由台风雨造成的洪水峰型尖瘦，涨落变化快，一次洪水过程一般为6 d～8 d。东江三角洲的潮汐属不规则半日潮，日潮不等现象显著。由于受径流和台风的影响，年最高潮位一般出现于汛期。

使用EXCEL工作表录入问卷调查数据，然后将数据导入SPSS进行统计分析。使用的主要统计分析手段有：相关性分析、频率分析、独立样本T检验均值比较等统计方法。

2 结果

2.1 EOB-MRI肝胆期图像中肝脏转运蛋白表达与肿瘤增强的关系 对6个ATP结合盒(ABC)和6个mRNA表达水平较高的溶质载体家族(SLC)转运蛋白进行相关性分析。结果发现其中3个ABC转运蛋白(BSEP， MRP2和BCRP)和4个SLC转运蛋白(NTCP,OATP1B1、OATP1B3和OATP2B1)与RER呈显著相关性(

<0.05)，见表2。其中RER与OATP1B3的相关系数最高。在免疫组织化学分析中，BSEP、 OATP1B1/1B3(识别OATP1B1和OATP1B3)和OATP1B3表达得分与RER呈显著相关性，但其他6个与RER呈不相关(

<0.05) ，见表2。代表性的EOB-MRI肝胆期肿瘤增强和BSEP、OATP1B1/1B3及OATP1B3免疫组织化学染色结果，见图1。由于3种转运体均与RER呈正相关，且OATP1B1/1B3和OATP1B3的相关系数几乎相同，因此认为OATP1B3是肝胆期EOB-MRI图像中最重要的肿瘤增强转运体，可对OATP1B3进行进一步研究。

1.3.1 MRI 采用GE Signa 3.0T磁共振扫描仪进行MRI

。影像分析由一位专业放射科医师完成。通过定义感兴趣区域(ROIs)来测量肿瘤和周围背景肝脏的信号强度(Sls)。结节相对于肝实质的相对增强采用如下方法计算：相对强度比(RIR)=SInod/SIpar，其中SInod是结节SI，SIpar是肝实质SI。相对增强比(RER)=RIRHBP/RIRpre，其中RIRHBP表示肝胆期图像中的RIR，RIRpre是对比前的RIR。进行RER分析能观察HCC肝胆期的信号差异，为推测HCC OATP1B3和Wnt/β-catenin靶基因的表达提供可能。

大型燃气联合循环电厂发电效率可以达到50%～60%，分布式热电冷联供系统总体效率可以达到70%～90%，而燃煤电厂机组发电效率仅为42%～47%。同时，燃气发电项目占地面积小，单位容量占地仅为燃煤火电厂的10%～30%。

1.3.3 病理检测 对纳入研究患者手术切除样本的组织切片进行苏木精和苏红染色。记录组织学特征，如肿瘤组织学等级、原发性或复发性肿瘤、生长模式、门静脉侵犯和肝内转移及肿瘤的高分化、中分化或低分化。当肿瘤结节位于肿瘤周围或由于预先干预而导致的坏死病灶内时，该肿瘤结节被认为是局部复发。病灶被定义为肝内转移复发的标准：①明显生长于门静脉血栓的结节；②在先前切除的肿瘤周围发现结节，并伴有多个卫星结节；③位于先前切除的肿瘤附近的孤立的小结节，其组织形态与原肿瘤的一部分相似

。根据METAVIR分类定义背景肝脏的肝纤维化分期

。肿瘤区域5%的胆汁小管、假性囊肿或细胞质内可见胆色素，则定义为肿瘤胆汁淤积阳性。

为研究Wnt/β-catenin信号传导的激活是否可诱导HCC细胞中OATP1B3的表达，采用Wnt/β-catenin信号激活剂LiCl处理KYN-2细胞，与未处理的细胞相比，经LiCl处理的KYN-2细胞显示出TOP/FOP比值呈显著的剂量依赖性增加，表明LiCl处理可激活KYN-2细胞中的Wnt信号传导。qRT-PCR结果显示，在10 mmol/L LiCl中，OATP1B3 、AXIN2和LGR5的mRNA表达明显上调，见表5。

2.4 EOB-MRI中肿瘤增强的临床病理特征及特异性分析经过ROC分析得到最佳RER临界值为0.864。采用免疫组化中的GS弥漫性强表达作为Wnt/β-catenin激活HCC的标志物，在该临界点下，Wnt/β-catenin激活的HCC预测的灵敏度，特异性和准确性分别为78.9%、80.5%和80.2%，见表6。

此外为分析OATP1B3可能的调控机制，选择3个已报道的调控OATP1B3表达的基因：HNF1α、HNF3β和FXR。其次，由于OATP1B3的表达在正常肝脏中呈明显的分区分化(由门周向周静脉区域逐渐增加)，因此选择了8个在小鼠肝脏中主要表达于周静脉区域的基因：细胞色素P4502E1(CYP2E1)、CYP7A1、谷氨酰胺合成酶(GS)、鸟氨酸氨基转移酶(OAT)、柠檬酸转移酶(CS)、葡萄糖激酶(GCK)、轴抑制蛋白2 (AXIN2)和富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(LGR5)。引物序列见表1。

2.5 RER高、低表达组患者的无事件生存情况及2年病情进展情况 见表8。

1.3.4 免疫组织化学分析 对福尔马林固定的石蜡包埋组织进行免疫组化染色分析。与背景肝脏相比，半定量地评估转运蛋白的膜表达强度和肝细胞核因子1α(HNF1α)的核表达，无表达为0分;与背景肝脏相比表达降低为1分；等效表达为2分；表达增加为3分。GS细胞质表达分类为：无表达或弱表达，异质性强表达或弥散性强表达。对β-连环蛋白表达评估，当在玻片中超过5%的细胞中观察到核染色时，核表达被定义为阳性。为了避免阅读偏倚，在MRI后至少3个月进行免疫组织化学分析。

未计价装置性材料费在整个工程单价中所占比例较大，无论是按建筑工程计费还是按安装工程计费，承包人的利润都将非常低。例如安装直径1 m的玻璃钢管输水管道（定额子目GB9040），按其他建筑工程计费时的利润约为4.2元/m，略高于间接费3.9元/m；按安装工程计费则约为5.5元/m，远低于间接费13.2元/m。

通常TGF-β1对正常上皮细胞发挥生长抑制作用，在恶性肿瘤发展过程中，TGF-β1起着双向调节作用。在肿瘤发生早期，TGF-β1发挥负向调节因子作用抑制肿瘤形成。随着肿瘤的进展，TGF-β1可通过诱导肿瘤周围基质环境改变，促进新生血管生成，促进肿瘤细胞浸润与转移，抑制宿主免疫系统杀伤肿瘤细胞等方式发挥免疫耐受和免疫逃逸，加剧肿瘤生长与形成[8-12]。

3 讨论

本研究结果表明，OATP1B3表达水平与EOB-MRI肝胆期图像中肿瘤增强呈显著相关性。在EOB-MRI的肝胆期图像中，OATP1B3是影响HCC增强的最重要转运蛋白。OATP1B3的表达随着肿瘤的去分化而逐渐降低，但少数高分化至中分化的HCC也表现出较强的OATP1B3表达，这一发现与已有文献报道一致

。本研究中所有复发肿瘤均无OATP1B3表达，提示具有侵袭性表型的肝癌组织可能会降低OATP1B3的表达。

有文献指出， OATP1B3可上调HNF1α和FXR，但抑制HNF3β表达

，OATP1B3在肝癌中的调控仍不清楚。因此，除了这3个基因外，本研究进一步分析了OATP1B3与另外在周静脉区域表达的8个基因之间的相关性。通过mRNA分析发现CYP2E1、GS、OAT、AXIN2和LGR5 5个基因与OATP1B3的表达呈显著相关性，这5个基因之前都被鉴定为Wnt/β-catenin相关基因

。免疫组化分析中GS表达和β-catenin核表达与OATP1B3表达得分也具有显著相关性。因此可推测在OATP1B3表达和Wnt/β-catenin信号通路之间存在显著的联系。

肿瘤胆汁淤积也与OATP1B3表达呈显著相关。肿瘤胆汁淤积与HCC β-catenin突变有显著相关性，因此在肿瘤胆汁淤积，OATP1B3表达和Wnt/β-catenin信号通路之间可能存在关联。但是，本研究结果表明仅OATP1B3表达与Wnt/β-catenin信号通路可能存在紧密的联系，而OATP1B3表达与胆汁淤积相关的基因(如HNF1a和FXR)则没有显著相关性

。但需要进一步研究以阐明这些关系。

Wnt/β-catenin信号通路的激活被认为是HCC一个重要的分子信号，被用于定义一个特定的HCC亚类。本研究结果提示，OATP1B3表达与GS、LGR5等基因呈高度相关性，OATP1B3上调的HCC可能是Wnt/β-catenin激活的HCC的一个特定亚类。与已有研究结果一致

。

本研究结果表明高RER结节和低RER结节的患者总生存率或无复发生存率比较，差异无显著性意义，然而，在表达OATP1B3的HCC中，侵袭性肿瘤特征(如门静脉侵袭和肝内转移)的发生率较低，尽管相关性并不显著。此外，先前曾报道LGR5过度表达的HCC细胞表现出更结节性和更少的转移表型

。因此， OATP1B3上调的HCC的侵袭性尚不确定，还需要进一步的研究来确定该HCC亚型患者的预后。采用EOB-MRI检测Wnt/β-catenin激活的HCC，灵敏度和特异性均为80%左右，RER临界值为0.9。随着技术的不断发展，这些结果可能会得到改进，单一测量的重复性也会提高。

总之，OATP1B3是EOB-MRI肝胆期图像中介导HCC增强的最重要转运蛋白，OATP1B3表达与Wnt/β-catenin信号通路密切相关。因此OATP1B3上调的HCC可能代表Wnt/β-catenin激活的HCC的特定亚类。

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