妊娠早期胎盘绒毛区优势血流与早期自然流产的相关性

张伊，王洪，张志坤，张骐，谢擎，王昕妍，张印峰

母胎循环与胎儿发育及母体妊娠并发症息息相关。胎盘作为母胎循环的主要器官，其解剖结构和生理特点仍有待进一步探索。既往相关研究多局限于解剖及组织学层面，随着超声技术不断发展，对胎盘无创、实时、动态的观察已经实现。3D多普勒超声已被应用于评估母胎界面[1-2]，但其精确性和可重复性仍存争议[3]。近年来，超微血流成像（superb microvascular imaging，SMI）[4]及SlowflowHD[5]等技术的出现，使超声精细化观察胎盘血流成为可能。本研究团队此前使用HD-Flow及SlowflowHD模式观察自然妊娠女性胎盘绒毛区时发现，脐带插入点下方的胎盘绒毛血流信号在整个胎盘血流中往往较为突出，最早可于孕4+5周检出，此时该信号位于卵黄囊下方绒毛区，且其长度与孕龄、血清人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）水平及头臀长相关[6]。本研究将该血流信号暂命名为“绒毛区优势血流”，并进一步探究其与胚胎早期发育及早期自然流产的关系，为胚胎及胎盘早期发育提供新的影像学证据。

1 对象与方法

1.1 研究对象纳入2020年9月—2021年2月在天津市中心妇产科医院（我院）生殖医学中心进行体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）术后14 d（相当于孕4周）血清hCG≥25 U/L的女性。根据IVF-ET常规方法计算孕龄：卵裂期（Day3）胚胎移植按照移植日期前17 d、囊胚（Day5）移植按照移植日期前19 d开始计算。我院生殖医学中心对通过IVF-ET妊娠的女性常规分别于孕5周、孕7周及孕12～13周进行超声检查。排除患高血压、糖尿病、免疫系统疾病及既往不良妊娠史者（复发性流产、妊娠合并糖尿病和妊娠期高血压）后，693例女性于孕5周开始行超声检查，确认单胎妊娠的508例女性于孕7周及孕12～13周行超声检查。排除标准：超声确认异位妊娠或双胎妊娠；退出、失访或未在研究规定时间参加超声检查。研究对象的纳入排除过程见图1。

图1 研究对象纳入排除过程

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集利用我院生殖医学中心电子病历信息系统获取研究对象年龄、妊娠前体质量指数（body mass index，BMI）、不孕原因和时间、基础性激素水平（月经周期第3～5天）、移植胚胎类型（新鲜胚胎或冻融胚胎）和孕4周时及孕5周行超声检查当日、孕7周行超声检查当日的血hCG水平等信息。孕5周超声下可见孕囊定义为临床妊娠。由我院生殖医学中心医护人员对研究对象进行妊娠期随访，记录是否发生流产及流产原因等。孕12周以内发生自然流产定义为早期自然流产，未发生早期自然流产定义为持续妊娠。本研究经过医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2.2 超声检查研究对象分别于孕5周（5～5+6周）、孕7周（7～7+6周）、孕12～13周（12～13+6周）3个时间段在我院超声科接受常规超声检查。孕5周和孕7周采取经阴道超声扫查，使用GE Voluson E10超声设备和RIC6-12-D探头；孕12～13周采取经腹部超声扫查，使用GE Voluson E8超声设备和RM6C探头。操作由经验丰富的高年资医师完成，另有一名有经验的医师在旁协同判定。确认卵黄囊（孕5周未见胎芽时）与脐带插入位置（孕7周及孕12～13周）后，局部放大其附近绒毛区并开启HD-Flow使取样框置于目标区域，使用HD-Flow调节焦点远离胚胎。调节多普勒流速标尺至0.9 cm/s（孕5周）、2 cm/s（孕7周）和4 cm/s（孕12～13周），嘱孕妇短暂屏住呼吸，并使用壁运动滤波器以过滤杂波，在目标区域内找到最接近卵黄囊或脐带插入点下方绒毛区一条走行长直、两端分别连接绒毛膜板和基板的血流信号，轻轻变换探头角度以确认其存在和走向。在该信号显示最完整的切面，以其接近孕囊的端点为起点，位于绒毛区和蜕膜交界处该信号与螺旋动脉交界的端点为终点，测量两点之间的距离作为绒毛区优势血流信号的长度（见图2），随后采集该血流信号绒毛膜板及基板处血流频谱，测量时根据具体情况进行角度校正（使其小于20°）。观察过程中严格遵循合理可行最低剂量（As Low As Reasonably Achievable，ALARA）原则[7]，依照标准[8-10]严格控制声输出功率与焦点和取样框深度，以确保热指数和机械指数在规定安全范围内（均小于0.7），且绒毛区接受多普勒超声时间总计不超过1 min。

图2 各孕周绒毛区优势血流信号长度测量

1.3 统计学方法使用SAS 9.4统计软件及R 4.1.2对数据进行分析。正态分布的定量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；非正态分布的定量资料采用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。定性资料采用例（百分比）表示，组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。结合早期自然流产组中该绒毛区优势血流信号长度的分布情况，选择不同孕龄绒毛区优势血流信号长度的第5百分位数作为界值，采用Logistic回归分析孕5周、孕7周时绒毛区优势血流信号长度在低于第5百分位数与早期自然流产风险的关系。双侧检验P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线特征最终纳入本研究分析的493例女性中，83例发生早期自然流产（自然流产组），410例持续妊娠（持续妊娠组）。2组的年龄、妊娠前BMI、吸烟与饮酒比例、孕次、产次、不孕因素、不孕时间、移植胚胎类型和移植胚胎质量差异均无统计学意义（均P＞0.05），基础雌二醇（estradiol，E2）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）、催乳素（prolactin，PRL）、睾酮（testosterone，TTE）、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）和促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）差异亦均无统计学意义（均P＞0.05）。持续妊娠组孕4周时及孕5周超声检查当日、孕7周超声检查当日血hCG水平显著高于自然流产组（均P＜0.001）。见表1。

表1 研究对象基线特征

2.2 2 组胚胎发育情况比较持续妊娠组孕5周孕囊径及卵黄囊径大于自然流产组，孕7周孕囊径、卵黄囊径、胎芽和胎心率均大于自然流产组，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表2。持续妊娠组在孕12～13周超声检查中头臀长为65.80（62.30，69.70）mm，胎心率为162.67（158.67，167.00）次/min。

表2 2组胚胎孕5周及孕7周发育情况 [M（P25，P75）]

2.3 绒毛区优势血流与其下方螺旋动脉特征

2.3.1 2组绒毛区优势血流信号在不同孕周的超声表现孕5周和孕7周持续妊娠组优势血流信号检出率及该血流信号长度均大于自然流产组（P＜0.05）；2组优势血流频谱类型差异有统计学意义（P＜0.001），均以静脉样频谱占比最高。孕5周持续妊娠组螺旋动脉阻力指数（resistance index，RI）低于自然流产组（P＜0.05），2组下方蜕膜区血流频谱类型、优势血流静脉流速和螺旋动脉收缩期峰值流速（peak systolic velocity，PSV）差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。孕7周持续妊娠组螺旋动脉PSV大于自然流产组（P＜0.05），2组下方蜕膜区血流频谱类型、优势血流静脉流速和螺旋动脉RI差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表4。持续妊娠组孕12～13周超声检查时，该优势血流信号检出率为100%，长度为13.80（12.10，15.60）mm，胎盘绒毛膜板静脉均测得静脉样频谱，流速为4.30（3.90，4.90）cm/s；基板处均可测得螺旋动脉频谱，PSV为27.30（19.80，39.20）cm/s，RI为0.46（0.40，0.54）。对不同孕龄绒毛区优势血流信号长度、优势血流静脉流速及下方蜕膜区螺旋动脉参数绘制散点图，可见2组该血流信号长度、优势血流静脉流速和下方螺旋动脉PSV随孕龄增加而增长，螺旋动脉RI随孕龄增加而下降。见图3。

表3 2组绒毛区优势血流信号在孕5周的超声表现

表4 2组绒毛区优势血流信号在孕7周的超声表现

2.3.2 绒毛区优势血流信号与早期自然流产的关系分析绒毛区优势血流信号长度在各百分位数下与自然流产的关系显示，孕7周时，优势血流信号长度＜P25和P25～P50的孕妇早期自然流产风险比优势血流信号长度≥P75的孕妇高。自然流产组优势血流信号长度多分布在研究对象总体的第5百分位数以下（见图3A），以血流信号长度第5百分位数为界值将研究对象分为＜P5组和≥P5组，校正年龄、BMI、胚胎质量等混杂因素后结果显示，孕7周时＜P5组发生早期自然流产的风险是≥P5组的10.84 倍（OR=10.84，95%CI：6.12～19.22，P＜0.001）。孕5周优势血流信号长度每缩短1 mm，早期自然流产风险增加41%（趋势性检验P=0.014）；孕7周优势血流信号长度每缩短1 mm，早期自然流产风险增加2.42倍（趋势性检验P＜0.001）。见表5。

图3 绒毛区优势血流信号各参数随孕龄变化散点图

3 讨论

3.1 实现超声对妊娠早期胎盘循环发育的观察本研究在对接受IVF-ET并成功获得单胎妊娠女性的检查中发现，脐带插入部位下方绒毛区存在一条贯穿于绒毛膜板和基板的血流信号。继之前对来我院就诊的自然妊娠妇女胎盘绒毛区的超声研究[6]后，再次证实了该血流信号的存在。

通过测量绒毛区优势血流信号频谱发现，该血流信号主要呈静脉样频谱，流速随孕周增加而增长。持续妊娠组该血流信号下方螺旋动脉PSV随孕周增加呈增长趋势，RI呈下降趋势，该结果符合胎盘绒毛不断发育并植入母体蜕膜对螺旋动脉进行侵袭重铸的过程[11]。自然流产组绒毛区优势血流静脉流速与持续妊娠组相似，但其下方蜕膜区螺旋动脉PSV在观察孕周略低于持续妊娠组（孕7周差异有统计学意义），而RI偏高（孕5周差异有统计学意义），推测可能是胚胎绒毛植入较浅、对下方螺旋动脉重铸不足所致，并最终导致早期流产。

3.2 对经典理论的证实与新的发现胚泡植入时，成胚细胞所在端为胚胎极，此处通常最先陷入子宫内膜，形成植入极，滋养层细胞在此优先生长并最终形成胎盘[12]。胎盘作为母胎循环器官，由母体-胎盘循环和胎盘-胎儿循环组成[13]。母体-胎盘循环结构形成时间大约为孕4～5周（受精后2～3周），此时子宫螺旋动脉被绒毛外滋养细胞侵入，血液流入绒毛间隙[11]。胚泡内的成胚细胞进一步分化为包括卵黄囊在内的各种胚胎结构，自妊娠第6周，卵黄囊、体蒂及尿囊一起被卷缩形成脐带[11]。本研究在孕5周卵黄囊下方发现的绒毛区优势血流，进一步证实了植入极滋养细胞生长的优先性，此时正值三级绒毛形成及胚胎原始心跳出现的时期[13]。孕7周后观察该血流常位于脐带插入点下方，此处绒毛区最接近胚胎，该优势血流的存在可能标志着胚胎植入母体子宫的位置及最早母胎循环的建立，其长度可代表胎盘绒毛发育程度。本研究发现，该血流在早期自然流产组明显缩短，且显著增加早期自然流产的风险，进一步说明了该血流信号的存在及其对于预测胚胎发育的重要性：其长度过短，提示滋养细胞在侵入母体蜕膜过程中遇到障碍，障碍可能来自母体（如蜕膜发育异常、母体疾病等）或胚胎本身，这需要未来更深入的研究证明；其下方螺旋动脉RI增高，提示此时已出现母胎循环阻力增加，不排除血管发育和血管重铸障碍。

部分研究证明，妊娠早期胚胎绒毛在重铸螺旋动脉过程中会堵塞螺旋动脉，维持胚胎绒毛的低氧环境利于其侵袭生长，至约孕3个月时解除[14-15]，但螺旋动脉是否会完全阻塞以及解除阻塞的具体时间尚存争议[16]。另外部分学者对妊娠早期胚胎绒毛血管观察后认为，孕第5周末（受精后第3周末）绒毛血管初步形成，此时其内尚无血细胞[12]。本研究通过多普勒原理可清晰捕获到绒毛区流动信号，在排除伪影等干扰后可观测其与螺旋动脉的连接以及频谱特征，对于该信号来自绒毛血管还是绒毛间隙仅通过超声技术目前尚不能证实，还需显微技术层面观察。但本次观察结果提示孕5周末绒毛区便可出现血流信号，符合以往部分超声观察结果[17-18]。

3.3 本研究的优势及局限性本研究在接受辅助生殖治疗获得妊娠的女性中进行观察，能够准确计算胚胎受精后的时间，为该血流信号长度分析提供了准确的时间标尺。利用电子病历信息系统获取研究对象详细的基本特征及治疗信息，并由专业医护人员进行跟踪随访，确保基线资料的准确性。利用HD-Flow超声技术，在妊娠早期胚胎、胎盘发育的观察中充分发挥了其无创、实时、在体的优点；观察位置明确，可重复性高。但本研究也存在一定局限性。首先，由于妊娠早期绒毛结构细微，观察难度较大，需要更为精细的操作，不排除对于子宫呈水平位或个别腹壁极厚者显像不清导致信息偏倚的可能；其次，超声观察属于间接观察，故尚不能确认该血流信号的组织来源及超微结构，期待组织学层面的证据；此外，由于随访时间及数据的限制，本研究中未能分析该血流信号与妊娠并发症风险及更远期的妊娠结局（如是否早产、活产儿出生体质量等）之间的相关性，有待未来进一步完善。

3.4 妊娠早期超声的安全性分析目前无明确证据表明妊娠期超声检查会对胚胎造成损害[19-21]。美国妇产科医师学会（The American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）、美国超声医学会（The American Institute of Ultrasound in Medicine，AIUM）、国际妇产科超声学会（The International Society of Ultrasound in Obstetrics and Gynecology，ISUOG）和中国医师协会超声医师分会等在2009—2016年发布的指南均肯定了妊娠期超声检查（包括妊娠早期超声检查）的安全性，并强调ALARA原则[20-23]。本研究在操作过程中严格执行相关指南建议并遵循ALARA原则，不会对胚胎安全性造成损害。

综上所述，本研究利用HD-Flow超声技术从孕5周便可清晰观察到卵黄囊下方胎盘绒毛区优势血流信号，其长度及其下方血流频谱参数对早期自然流产有一定的预测价值，由于其与着床位置密切相关，对于异位妊娠的判断、病理妊娠的预测将有重大意义。随着对胚胎理论研究的不断深入和理解、其他方法学研究的跟进，“妊娠早期绒毛区优势血流”有望得到进一步证实，可为临床提供极大帮助，并为胚胎学基础理论、母胎界面分子生物学研究开拓新角度并奠定影像学基础。