芥菜疙瘩超微粉对小鼠慢性阻塞性肺炎的改善作用

陈岭林，查学强，李强明，罗建平*，杨磊

（1.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥 230601）

（2.安徽碗北老家农业开发有限公司，安徽阜阳 236400）

芥菜疙瘩（Brassica napiformisL. H. Bariley）又名辣疙瘩、大头芥、大头菜，是十字花科芸薹属植物芥菜的一个变种，为我国常用的蔬菜之一。传统中医药记载，芥菜具有宣肺豁痰、温中利气的功效。现代研究表明，芥菜疙瘩中不仅具有普遍的生物活性成分（如膳食纤维、多糖、维生素、多酚和黄酮等），而且还具有十字花科植物特有的硫苷和其代谢产物异硫氰酸酯等生物活性成分，具有抗炎[1]和抗氧化[2]的生物活性。芥菜疙瘩在全国各省均有种植，其栽培面积超过1.0×106hm2，产量约 4.5×107t[3]。目前芥菜疙瘩的加工仍以传统腌制小菜为主，加工手段初级、产品类型单一、附加值低、市场竞争力弱，迫切需要改变传统的加工模式，寻找新的加工利用途径，从而改变产业发展困滞于产业链低端的局面。

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见的伴有气流阻塞的慢性疾病，是世界上第四大致死疾病[4]。在中国，呼吸系统疾病死亡人数（主要是慢性阻塞性肺疾病）在主要疾病的死亡人数中排名第四[5]，且农村死亡率明显高于城市。果蔬超微粉对果蔬的有效成分具有更高的溶出率，其生物活性功能优于普通粉[6-9]，采用超微粉碎技术对芥菜疙瘩冻干样品进行粉碎，能基本完整保留芥菜疙瘩的功效成分。本研究基于果蔬超微粉的优良特性[10]，以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）鼻腔滴注构建 COPD小鼠模型，并以芥菜疙瘩普通粉（Brassica napiformisordinary powder，BOP）为对照，从抗炎和抗氧化的角度研究芥菜疙瘩超微粉（Brassica napiformisultrafine powder，BUP）对COPD小鼠肺炎的影响，旨在为芥菜疙瘩超微粉的高值化加工利用提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料与动物

芥菜疙瘩由安徽省临泉县安徽碗北老家农业开发有限公司提供；BUP（粒径18.311±0.008 μm）由芥菜疙瘩切块冻干后经中药超微粉碎机以进样体积0.6 L、粉碎时间20 min制得；BOP（粒径86.025±0.293 μm）由高速破碎机破碎芥菜疙瘩冻干样品并过 60目孔筛制得。SPF级 C57BL/6J小鼠（合格证编号：NO.202011402），购买于常州市卡文斯实验动物有限公司（许可证号：SCSK(苏)2016-0010）。小鼠饲养在标准 SPF级动物房（温度：23±2 ℃，相对湿度：50%～60%，光照12 h/d），自由摄食摄水，适应性喂养1 w。

1.1.2 主要实验试剂

异硫氰酸烯丙酯、萝卜硫苷，Sigma Inc.；芦丁、没食子酸，上海源叶生物科技有限公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、地塞米松（Dexamethasone，Dex），白鲨生物科技有限公司；一氧化氮（Nitric oxide，NO）、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、ECL化学发光、RNA抽提试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；过氧化氢酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxidase，SOD）试剂盒，南京建成科技有限公司；小鼠IL-1β、IL-6、IL-10 Elisa试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix、iScript cDNA Synthesis试剂盒，Bio-Rad Laboratories, Inc.；CD11b、MHCII、F4/80、CD11c、FoxP3、CD25 抗体，BD Biosciences；CD68、Ly6G 抗体，赛维尔生物科技有限公司；p65、IκB、p-IκB、NF-κB、Nrf2 抗体，Proteintech，Group, Inc.；Phospho-NF-κB p65 抗体，Abclonal Biotech Co. Ltd.。

1.2 主要仪器与设备

TU-1901紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；SC21CL冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；XDW-6J超微粉碎机，济南达微机械有限公司；Sl-150高速多功能粉碎机，江苏永康市松青五金厂；WIX-EP600电泳仪，韦克斯科技(北京)有限公司；Varioskan Flash全波长酶标仪，Thermo Fisher公司；Image Quant LAS 4000 mini荧光成像系统，GE Healthcare公司；MoFlo XDP流式细胞仪，Beckman Coulter公司；P250 FLASH病理切片扫描显微镜，3D HISTECH公司。

1.3 实验方法

1.3.1 芥菜疙瘩粉体活性成分的测定

取适量BUP和BOP，按照GB 5009.88-2014测定其膳食纤维的含量，按照唐明明等[11]的方法测定多酚和黄酮的含量，按照Doorn等[12]的方法测定硫苷的含量，按照方海仙等[13]的方法异硫氰酸酯的溶出率；每组样本独立检测3次。

1.3.2 小鼠实验分组造模、给药及一般情况观察

小鼠随机分成 7组（n=8），分别为正常组（Control）、模型组（LPS）、阳性药组（LPS+Dex）、超微粉高剂量组（LPS+6% BUP）、超微粉低剂量组（LPS+2% BUP）、普通粉高剂量组（LPS+6% BOP）和普通粉低剂量组（LPS+2% BOP）。造模参照Janbazacyabar等[14]的方法，第 28 d造模结束后，LPS+Dex 按照 1 mg/(kg·d)地塞米松剂量给药[15]，芥菜疙瘩粉体饲料高、低剂量[16]分别是100 g饲料中含有对应粉体含量的6 g和2 g，其余组都给予正常饲料，连续30 d。整个周期结束后，对小鼠进行隔夜禁食处理。实验期间对小鼠一般情况观察并记录体重变化。

1.3.3 小鼠肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的流式细胞计数分析

CO2处死小鼠，收集小鼠BALF[17]，将收集的细胞混匀后分成5个组别，即调节性T细胞（Treg）组、树突状细胞（DC）组、肺泡巨噬细胞（AM）组、中性粒细胞（NE）组以及活性氧（ROS）组，分别加入各细胞对应的荧光抗体，即 Treg为 CD25-FITC和Foxp3-APC、DC为CD11c-APC和MHCII-PE、AM为CD11c-APC和F4/80-FITC、NE为CD11b-FITC和Ly6G-PE，室温（25 ℃）环境下孵育30 min后以流式细胞仪检测几种细胞的比例；BALF中ROS含量变化按照试剂盒说明书测定[18,19]。每组样品重复上述实验平行三次，实验结果采用flowjo（V 10.5.3，BD Life Sciences，USA）进行数据分析。

1.3.4 肺组织病理学染色和免疫组化分析

CO2处死小鼠，收集小鼠肺组织，计算肺系数（肺组织重量与该小鼠对应体重的比值）；肺组织以 4%多聚甲醛固定后分别按Li等[20]、Fleur等[21]和Wang等[22]的方法制备H&E染色、Masson染色、CD68和Ly6G免疫组化切片，并在显微镜下观察、拍照。

1.3.5 小鼠肺组织中细胞因子和氧化应激相关因子的测定

取适量肺组织，分别以IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA检测试剂盒对小鼠肺组织中细胞因子的含量进行测定；分别以超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、一氧化氮和丙二醛检测试剂盒测定小鼠肺组织中氧化应激相关因子的含量。

1.3.6 肺组织RT-PCR分析

取适量肺组织，按照RNA提取试剂盒提出RNA，以 iScript cDNA Synthesis试剂盒进行逆转录，参照iTaq Universal SYBR Green Supermix试剂盒进行血红素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）和醌氧化还原酶-1（NADPH quinineoxidoreductase-1，NQO-1）的荧光定量PCR实验，所得数据采用2-ΔΔCt法计算其相对mRNA的水平（以GAPDH为内参）。引物购买于生工生物工程股份有限公司，序列为：GADPH正向：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；HO-1正向：5′-CTGACCCATGACACCAAGGAC-3′，反向：5′-AAA GCCCTACAGCAACTGTCG-3′；NQO1 正向：5′-GGC AGAAGAGCACTGATCGTA-3′，反向：5′-TGATGGG ATTGAAGTTCATGGC-3′。

1.3.7 肺组织Western blot实验

取适量肺组织，对肺组织内的全蛋白进行提取，对所提蛋白进行Western blot实验[23]，分别分析肺组织内 p65、p-p65、IκB、p-IκB、Nrf2 等蛋白的表达水平。用Image Quant LAS 4000 mini荧光成像系统进行成像并拍照保存，拍照结果用Image J软件（以β-actin作为内参）进行灰度值分析。

1.4 数据处理

所有实验数据均使用SPSS 26.0软件进行统计分析，结果以Mean±SD表示，运用One-Way ANOVA检验方法分析各组之间的显著性差异，不同字母表示组与组之间具有显著性差异（p＜0.05），根据统计的结果，用Orign 9.0软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 BUP的活性成分溶出率

表1 芥菜疙瘩普通粉（BOP）和超微粉(BUP)活性成分溶出率比较Table 1 Comparison of the dissolution rate of active ingredients in BOP and BUP

BUP的粒径只有BOP的21%，两种粉体的活性成分溶出率测定（表1）表明，BUP中可溶性膳食纤维、多酚、黄酮以及其特有的硫苷和异硫氰酸酯的溶出率均高于BOP，表明超微粉碎可使芥菜疙瘩中的活性成分更加容易释放出来。

2.2 BUP对COPD小鼠一般情况及肺组织病理学的影响

小鼠经过LPS造模以后，与正常组相比，其体重增长速度开始减缓，精神状态欠佳。造模结束后开始给药，与模型组相比，阳性组小鼠和芥菜疙瘩粉体组小鼠体重增长速度开始恢复，精神状态开始恢复；并且BUP组小鼠的体重恢复速度比BOP组小鼠更快。解剖小鼠后对小鼠肺组织进行肺系数计算可知，与正常组相比，模型组小鼠肺系数明显增大；与模型组相比，阳性药和芥菜疙瘩粉体组小鼠的小鼠肺系数降低。如图1所示，LPS造模会导致COPD小鼠肺组织发生炎性细胞浸润，肺泡壁和支气管增粗（图1a）、肺组织纤维化（图1b），同时也会导致小鼠肺组织支气管发生巨噬细胞浸润（图1c）和肺泡壁中性粒细胞浸润（图1d）。通过给小鼠日粮饲料添加BUP可以缓解小鼠的COPD症状，虽然其作用效果与阳性药地塞米松相比略有不足，但对肺组织的改善效果优于BOP。

2.3 BUP对COPD小鼠肺泡灌洗液免疫细胞比例的影响

小鼠BALF中炎性相关细胞Treg、AM、DC和NE的流式细胞分析表明，与正常组小鼠BALF中Treg细胞比例（6.88%）相比，LPS造模导致小鼠 BALF中的Treg细胞比例变少（3.02%），阳性药地塞米松明显改善其比例（6.45%），芥菜疙瘩粉也能提升Treg的比例，其中BUP的效果最优（5.89%）（图2a）。同时，与正常组的AM（3.43%）、DC（19.87%）和NE（1.62%）的细胞比例相比，模型组小鼠BALF中的AM、DC和NE均显著提高，分别升高了3.56、0.39和7.02倍，而给药地塞米松和芥菜疙瘩粉体均能降低COPD小鼠BALF中AM、DC和NE细胞的比例，且BUP降低的比例优于 BOP（图 2b、2c、2d）。研究结果表明芥菜疙瘩能调节小鼠BALF中的细胞比例，进而改善LPS引起的COPD。

2.4 BUP对COPD小鼠肺组织炎症相关因子的影响

LPS造成炎性细胞大量聚集，释放大量的炎性细胞因子参与肺的炎症损伤过程[24]。通过图 3a、3b分析得知，与正常组的促炎因子 IL-1β（226.95±4.48 pg/mg prot）和IL-6（134.97 pg/mg prot）的水平相比，通过LPS诱导小鼠COPD以后，肺组织中IL-1β和IL-6的水平分别增高到329.74 pg/mg prot和199.55 pg/mg prot，通过给药阳性药和芥菜疙瘩粉体具有抑制IL-1β和IL-6增多的趋势；同理，如图3c所示，与正常组抗炎因子 IL-10的水平（219.48 pg/mg prot）相比，COPD模型小鼠肺组织中其水平明显降低（165.48 pg/mg prot），通过给予阳性药和芥菜疙瘩粉体均能增高IL-10的水平，从而改善COPD小鼠的炎症水平。

2.5 BUP对COPD小鼠肺组织炎性信号通路的影响

NF-κB信号通路是目前已知最主要的调节炎症的通路之一，主要参与调控机体内细胞因子的产生和细胞的存活，在调节致病菌感染的免疫应答中起关键作用[25]。如图4所示，通过对小鼠肺脏的炎性通路蛋白进行western bloting分析，结果表明，与对照组相比，LPS诱导小鼠肺脏NF-κB通路的激活，其肺组织内的p-p65（p-NF-κB）和 p-IκB 的表达增加，表明 NF-κB-p65可能向核内转移促进炎症因子的表达，从而诱导炎症的发生；而BUP能抑制COPD小鼠肺组织内p65和IκB的磷酸化，从而改善COPD小鼠的炎症，同时可以看出BUP在改善COPD小鼠炎性信号通路的效果优于BOP。

2.6 BUP对COPD小鼠氧化应激相关因子和抗氧化酶系统的影响

越来越多的证据证明，活化的细胞体内耗氧量会增加，从而导致ROS的过量产生，因此维持机体ROS的稳态至关重要[26]。从图5可以看出，正常小鼠经LPS诱导COPD后，其肺泡灌洗液活性氧平衡被破坏（5a），肺组织内NO含量增加（5b，由15.14 pg/mg prot增加至27.41 pg/mg prot），CAT（5c），GSH-Px（5d）和SOD（5e）表达下降（分别由3.62 U/mg prot、251.43 μmol/mg prot、91.00 U/mg prot下降至 1.88 U/mg prot、90.36 μmol/mg prot、10.72 U/mg prot），促使氧自由基过量产生对机体有伤害的物质MDA（5f，含量增加了152.71%），表明LPS破坏了COPD小鼠细胞膜，致使肺组织发生损伤。通过给予地塞米松和芥菜疙瘩粉体后能够降低COPD小鼠体内的NO和MDA，升高CAT、GSH-Px和SOD的水平，进而平衡氧化应激过程。

2.7 BUP对COPD小鼠抗氧化通路的影响

如图6所示，LPS造模会导致COPD小鼠肺组织内的HO-1 mRNA（6a）、NQO-1 mRNA（6b）表达下降，说明机体内的解毒酶表达不足。Nrf2被认为是一种调节抗氧化能力的转录因子，Nrf2信号通路的激活是细胞防御氧化应激的主要机制[27]。通过对小鼠饲喂芥菜疙瘩粉体，能够增加Nrf2蛋白水平的表达（6c、6d），Nrf2被转运到细胞核从而可能上调大量抗氧化酶（CAT、GSH-Px和SOD等）和异种生物解毒基因（HO-1 mRNA和NQO-1 mRNA等）的表达，进而改善小鼠的COPD。

3 结论

本研究以芥菜疙瘩制备BUP，并与BOP对比，研究BUP活性成分浸出率的变化和其对COPD小鼠的改善作用及机制。相较于BOP，BUP具有更高的活性成分浸出率，且BUP能够通过抗炎和抗氧化通路调节COPD小鼠的免疫细胞比例、细胞因子和氧化应激相关因子的释放，改善COPD小鼠的肺气肿和肺纤维化，从而改善COPD小鼠的肺炎，且其效果优于BOP。综上可知，BUP活性成分溶出率高且能够改善 LPS诱导的COPD小鼠，该结果为芥菜疙瘩的精深加工利用和功能食品的开发研究提供了新的理论依据。