一株致皮蛋“爆蛋”的嗜碱菌株分离鉴定及其De nove测序分析

张昊，杨林杰，张腾飞，孙静，梁振华，皮劲松，杜金平

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉 430064）

皮蛋是具有悠久历史的中国传统蛋制品，由鲜鸭蛋经5周左右腌制而成，其风味独特，营养丰富。皮蛋制作不但延长了蛋品的保存期，还使其具有抗肠炎[1]、调控肠道微生物菌群等功能[2]。鸭蛋由蛋壳包裹，蛋清黏度高，且蛋清中含溶菌酶，这些特点可一定程度阻止细菌的入侵、增殖[3]。但受原料蛋品质和加工条件和影响，某些皮蛋加工企业也会出现“爆蛋”现象。“爆蛋”是由于皮蛋内压力增大，超过蛋壳承载力导致的。皮蛋加工过程出现“爆蛋”，往往不是单个蛋品出现，而是整缸或成批出现，对企业造成巨大损失。因此，对皮蛋“爆蛋”进行微生物溯源，提出控制“爆蛋”的有效方案具有重要产业意义。

麦氏弧菌（Vibrio metschnikovii）是麦契尼可夫弧菌的简称，是一种厌氧/兼性厌氧短杆菌，属于非 O1群霍乱弧菌，一般不致病[4,5]，于1981年首次分离得到[6]，广泛存在于污水[7,8]、人畜粪便[9]、水产品[10,11]、河流、海湾[12]和污染的水禽蛋[13]中。由于其分布广泛、致病力不强，相关报道有限。一般认为该菌属嗜盐性菌，在无盐胨水中不能生长[14]。且该菌不耐低温，具有耐碱和胆盐的特征[15]。目前有关于麦氏弧菌影响再制鸭蛋成品率的研究报道较少。

全基因组De novo测序也称为从头测序，可不依赖参考基因组序列，进行建库测序。测序结果通过拼接组装，绘制测序物种的完整基因组序列图谱。基因组测序不仅可以获得测序物种的全基因组序列图谱，分析开放性阅读框，确定基因数量，还可通过进一步分析，确定测序物种进化特点、生物学分类、基因功能富集情况和主要代谢通路，为特定环境适应性等相关研究奠定基础[16,17]。

本研究从爆蛋样品中分离出一株革兰氏阴性菌，命名为BD菌株。通过形态学观察，16S rDNA序列比对，初步鉴定其为弧菌属细菌。通过弧菌试剂盒检测生理生化功能，确定其生长代谢特点。并确定了其最适生长温度、耐盐度和耐碱度，为皮蛋加工企业“爆蛋”控制方案制定提供参考。鉴于菌株生长环境特点，进一步通过De novo测序，初步解析BD菌株适应高碱度环境的生物学机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“爆蛋”皮蛋样品由湖北省江夏区某皮蛋加工厂提供。

主要培养基：LB固体培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基、MC培养基、MRS培养基、芽孢杆菌培养基、MA培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司。

主要试剂：DP302 TIANampBateria DNA Kit，天根生化科技（北京）有限公司；KOD taq、Loading buffer、核酸染料，Transgene生物科技有限公司；弧菌科细菌生化鉴定盒（16种×5次），广东环凯微生物科技有限公司；NEBNext®UltraTMDNA Library Prep Kitfor illumine试剂盒，NEB有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；Eclipse Ts2R倒置显微镜，尼康株式会社；LX-B35 L型立式压力蒸汽灭菌锅，合肥华泰医疗设备有限公司；PCR仪，美国赛默飞世尔科技公司；PYL-125型生化培养箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；GelDocXR+全自动凝胶成像系统，美国Bio-red公司。

1.3 方法

1.3.1 “爆蛋”样品细菌的分离纯化

鉴于“爆蛋”皮蛋样品蛋白无明显变化，蛋黄内出现变质、颜色异常，因此，将“爆蛋”样品变质蛋黄作为菌株的分离材料，取各批次“爆蛋”蛋黄0.5 g进行后续试验。样品无菌条件下充分研磨后转入加入200 mL，0.9%无菌NaCl的锥形瓶，200 r/min振荡30 min，静置5 min，用0.9% NaCl 10倍梯度稀释，选择5个稀释梯度，各取100 μL梯度稀释液于不同培养皿内，并涂布均匀，倒置于培养箱中37 ℃培养24±2 h。根据菌落的形状，大小和颜色等形态特征，挑取不同选择培养基上单菌落进行纯化，镜检，斜面保藏。

1.3.2 细菌形态特征的观察

菌落特征：对菌落的颜色、大小、形状、光滑度和透明度等进行观察并记录。

对菌落形态进行观察和拍照。将分离纯化后的细菌进行革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态特征。

1.3.3 菌株基因组DNA提取及16S rRNA基因扩增测序

将待测菌株分别使用分离菌株所采用的固体培养基对应的液体培养基37 ℃、200 r/min振荡培养24 h获得新鲜细胞悬浮液，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取 DNA（步骤参照说明书）。以提取的 DNA为模板，选择细菌 16S rDNA的通用引物 27F（ 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）进行 PCR扩增。PCR反应体系为25 μL：2×FastTaq Premix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.75 μL，添加ddH2O至25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，确定扩增片段长度于目标片段长度相同、无杂带后送往武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行纯化并测序。

1.3.4 同源性及进化树分析

扩增产物经1.5% TAE琼脂糖凝胶电泳检测后，送武汉生工生物技术有限公司进行测序，将测序进行BLAST 比对（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），综合分析菌株16S rDNA序列比对结果。选择同源性高的细菌序列，用 MEGAX 软件，采用Neighbor-Joining法构建菌株系统发育树。

1.3.5 细菌生长曲线绘制

浓度为1.0×106CFU/mL的细菌培养液，以1%的接种量接种于LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min振荡培养，分别选取0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h时间测定菌液的OD600值。以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制细菌生长曲线，共进行3次重复试验并统计分析。

1.3.6 细菌培养特性试验

通过表2可知，磁性纤维素在293、303和313 K温度下Langmuir模型的线性相关系数R2>0.99，而且由Langmuir模型所得各个温度饱和吸附容量与磁性纤维素对亚甲基蓝溶液吸附容量实测值比较接近，说明磁性纤维素对亚甲基蓝溶液吸附更适合用Langmuir模型描述，吸附主要为单分子层吸附，最大吸附容量为123.15 mg·g-1。

（1）细菌生长最适温度试验

将细菌的培养液接种到3.5 mL的LB液体培养基中，分别在 15、20、25、30、35、40、45、50 ℃条件下，200 r/min培养过夜。次日分别测取OD600值，进行3次重复并统计分析。

（2）细菌耐碱试验

将细菌的培养液接种到3.5 mL的LB液体培养基中，调节培养基的pH值分别为8、9、10、11、12、13、14。接种后200 r/min，37 ℃培养12 h后，取适量样品测OD600值。进行3次重复，统计分析。

（3）细菌耐盐试验

将细菌的培养液接种到3.5 mL的LB液体培养基中（pH 10±0.2），并调节培养基中的NaCl浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%，37 ℃培养12 h后，取适量样品测OD600值。进行3次平行试验，统计分析。

（4）细菌生化试验

1.3.7 细菌基因组De novo测序

采用SES方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和完整性，利用Qubit进行定量后，对DNA样品用超声破碎仪随机打断成长约350 bp的片段。利用建库试剂盒，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤制备测序文库。文库构建后，使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至2 ng/μL，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，片段大小符合预期后，使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。构建好的的文库通过 Illumina PE150平台进行细菌框架图测序。测序完成后，构建细菌基因组框架图，并对基因进行GO富集、KEGG分析等生物信息学分析。

1.3.8 统计分析

本试验统计分析采用单因素方差分析，应用SPSS软件中的ANOVA方法计算均值±SD和p值。

2 结果与分析

2.1 “爆蛋”样品分离获得的细菌形态、菌落特征及16S rDNA序列分析

多批次样品细菌分离结果发现，“爆蛋”样品中的微生物可在LB固体培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基中生长，菌落均呈浅黄色，表面光滑且不透明。分离纯化后，菌落形态相同，均如图1所示，在LB固体培养基中形成浅黄色、表面光滑、边缘整齐且不透明的近似圆形的菌落。显微镜检特点相同，菌株革兰氏染色阴性，短杆状，不透明菌株。单个存在，少数链状排列（图1）。

微生物的16S rDNA结构具有保守性，可反映微生物间的亲缘关系和进化特征。16S rDNA序列比对法对未知菌株种属分类具有快速、准确、灵敏等优点。对BD菌株的基因组DNA模板进行16S rDNA片段PCR扩增，扩增到大小约为1400 bp条带。利用NCBI中blast工具对BD菌株16S rDNA扩增片段测序结果进行比对分析，BD菌株（Genbank accession number：MZ723937）与弧菌属多个近缘种的16S rDNA基因相似性在 99%以上，其中与麦氏弧菌（Vibrio metschnikoviistrain KT986183.1），印第安弧菌（Vibrio injenensisstrain KC634073.2），辛辛那提弧菌（Vibrio cincinnatiensisstrain NR026122.1），需钠弧菌（Vibrio natriegensstrain NR115679.1）的相似性分别为99.92%、99.75%、99.83%、97.76%。由于16S rDNA的保守性高，未知菌属序列比对分析是目前确定其分类的常用手段，但对相似率极高的近缘种只能进行属水平上的鉴定。

选取 7个同源性较高的不同种的弧菌序列，用MegaX软件建立系统发育树。从系统发育树可以看出，BD菌株与麦氏弧菌处于较近分支，且聚集在一起，形成一簇（图2）。综合序列比对结果和系统发育树构建结果，初步确定 BD菌株为麦氏弧菌（Vibrio metschnikovii）。进一步利用菌株De nove测序结果的分析，可将菌株鉴定到种。

2.2 细菌生长曲线结果

供试菌在培养4 h后进入对数生长期，并持续到12 h左右，14 h后进入稳定期（图3）。在试验组中，所有检测点3组数据均差异不显著（p＞0.05），重复性良好。

2.3 细菌培养特性试验结果

供试菌在 15 ℃培养条件下，生长缓慢，当温度达到25 ℃，即可开始生长，最适生长温度为25～40 ℃（图4）。供试菌株的OD600值随pH值的增大呈先增加后下降的趋势，其在pH 12时OD600值达到最大值，pH进一步增加，细菌则无法增殖（图5）。供试菌培养基中NaCl浓度从2.5%至5%增加时，该弧菌增殖速度随盐浓度的提高而加快，当 NaCl浓度从 5%至7.5%继续增加时，该弧菌增殖速度变慢（图6）。细菌培养特性试验的试验重复性均表现良好。

由于该菌株多富集于水体、海鲜及动物粪便中。基于BD菌株的生长特性，加工企业应重点关注原料蛋品收集、运输，减少使用细菌污染的次品蛋，尤其我国南方地区在春夏之交，气温升高的气候条件下更需重点关注。此外，在腌制车间内、蛋品出缸后以及商品皮蛋在储运、货架期管理时，也要注意控温，避免温度过高，引发“爆蛋”。

2.4 生理生化特性

供试菌株蔗糖、阿拉伯糖、肌醇分解试验结果阴性；甘露糖分解试验结果阳性。菌株1% NaCl葡萄糖产气、1% NaCl精氨酸双水解酶试验结果阳性；1%NaCl赖氨酸脱羧酶试验结果阴性。低浓度（0%～6%）NaCl胨水试验阳性，高浓度（8%～10%）NaCl胨水试验阴性。相关试验结果详见（表1）。该结果表明，BD菌株除适应高碱环境外，还具有产气能力，能够在6%的盐浓度条件下生长。

表1 BD菌株的生理生化分析Table 1 Physiological and biochemical analysis of BD strain

2.5 细菌基因组De novo测序分析

通过对下机数据处理，序列组装发现，BD菌株基因组大小为3.70 Mb，GC含量43.62%。基因组分析表明，BD菌株共编码3381个基因，基因平均长度为942 bp，编码基因长度占基因组比例为86.58%。非编码RNA预测发现，BD菌株共有84个tRNA，13个sRNA。采用IslandPath-DIOMB软件预测BD菌株基因岛发现，BD菌株存在5个基因岛，基因岛总长度40270 bp，平均长度8054 bp。

选取GO、KEGG和COG三个数据库对功能基因进行注释。其中，GO（Gene Ontology）按照功能基因的分子功能、生物学过程和细胞组分进行聚类。GO注释结果的分类如图7所示，细菌生物学过程和分子功能基因活跃，其中参与细胞过程（1348条）、代谢过程（1345条）、结合（1133条）、催化活性（1262条）的基因较多。

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）从分子信号通路角度进行注释，获得菌株相关分子间的互作网络。BD菌株KEGG代谢通路分析结果如图8所示。从KEGG通路注释结果表明，该菌株参与碳水化合物代谢及膜转运的相关基因数量最多，此外，参与氨基酸代谢、维生素和辅因子代谢通路的相关基因数量也较多。通过对蛋白编码基因功能注释表明，该菌株基因组中含有大量碳水化合物代谢通路、膜转运功能相关通路基因。有研究表明，嗜碱细菌细胞膜上的Na+/H+转运载体在调节细胞质pH方面起关键作用[18,19]。BD菌株中的大量膜转运相关基因可转录翻译成的蛋白，以离子泵的形式保证细菌胞质中pH值相等稳定[20]。分离菌株基因组中同时含有较多的碳水化合物代谢通路相关基因，这些功能基因可能参与细菌利用蛋内碳源物质为离子转运供能。对于GO注释将基因富集到的基因中，双组分传感因子活性相关基因可能与该菌株适应碱性环境有关[21]，甘油-3-磷酸盐分解代谢活性相关基因可能也参与了碱环境适应[22]。

COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）数据库注释结果表明（图9），BD菌株相关基因富集于氨基酸转运代（250个）；翻译、核糖体结构和起源（234个）；转录因子（218个），结果对GO注释和KEGG注释结果进行了补充和印证。

NR数据库（Non-Redundant Protein Database）是一个非冗余的蛋白质数据库，其特点在于内容比较全面，同时注释结果中会包含有物种信息，可作物种分类用。该数据库由NCBI创建并维护，根据基因编码蛋白注释到的物种情况，统计注释到的物种及蛋白数目。结果表明，BD菌株编码的3381个蛋白，有2641个注释到麦氏弧菌中，其富集度最高（见图 10）。结合前期16S rDNA测序比对结果，确定从皮蛋“爆蛋”样品中分离获得的 BD菌株为麦氏弧菌（Vibrio metschnikovii）。

3 结论

3.1 本研究通过分离、镜检、染色、16S rDNA测序比对和De novo从头测序，确定从皮蛋“爆蛋”样品中分离获得的 BD 菌株为麦氏弧菌（Vibrio metschnikovii）。生长特性研究发现其适宜生长温度为25～40 ℃，可耐受pH≤12的碱环境，耐盐且具有产气能力。但该腐败菌BD菌株如何侵入蛋品内部，其代谢过程中产生的气体是何种成分，还需要进一步开展相关研究。

3.2 研究分离获得的BD菌株De novo测序分析表明，该菌株基因组中有大量参与碳水化合物代谢、膜转运、氨基酸代谢、维生素和辅因子代谢通路的基因，通过相关基因表达来适应高碱环境，为皮蛋“爆蛋”菌在蛋黄中的生长机制研究提供了一定基础，但功能基因的挖掘和作用机制研究也有待后续试验进行深入研究。