TRPP2在哮喘大鼠气管平滑肌细胞中的变化及对气管收缩的影响 *

申永刚1，高汇雯，胡昕伟，李汶鸿3，何静，张雪飞，王涵，丁圣刚3，沈兵

(1. 安徽卫生健康职业学院护理系内儿教研室，安徽 池州 247099；2. 安徽医科大学基础医学院生理学教研室，安徽 合肥 230032；3. 安徽医科大学第一附属医院儿科，安徽 合肥 230022)

瞬时受体电位多囊蛋白2(transient receptor potential polycystic 2，TRPP2)在平滑肌细胞中广泛表达，参与介导细胞内钙释放和外钙内流[1]。钙库操纵的钙内流(store-operated Ca2+entry，SOCE)参与细胞钙信号的传输，一旦内质网的钙储备耗尽，位于细胞膜上的某些钙通道将被刺激打开，从而允许钙离子渗透[2]。作为常见和发病率不断增加的呼吸系统疾病之一，哮喘的发生发展机制有待深入研究[3]，但气道平滑肌细胞的变化引起哮喘发作的作用机制尚不明确。本研究拟对大鼠造模后，进行气管张力等研究，试图阐明哮喘大鼠气管平滑肌细胞中TRPP2的表达量变化及其对气管收缩过程的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 维拉帕米(Verapamil)购自西亚试剂(批号：I41674)，卡巴胆碱(Carbachol)购自日本东京化成工业株式会社(批号：HXXJE-BE)、卵清蛋白(ovalbumin，OVA)购自Sigma公司(批号：102329400)；TRPP2抗体购自北京博奥森公司；Krebs溶液配方为118 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2、4.7 mmol/L KCl、25.2 mmol/L NaHCO3、11.1 mmol/L glucose、1.2 mmol/L KH2PO4、1.2 mmol/L MgSO4·7H2O，持续通入95% O2和5% CO2；将等摩尔的NaCl替换为KCl并使KCl终浓度达到60 mmol/L即为高钾溶液。

1.2实验动物 均为雄性SD大鼠，体重(200～220) g，购自常州卡文斯实验动物有限公司。生产许可证号：SCXK(苏)2016-0010。

1.2方法

1.2.1哮喘造模 先适应性饲养10只同周龄雄性大鼠7 d，然后将其随机分为对照组和哮喘组。参照杨飞等[4]的造模方法，造模时长共为20 d，哮喘组大鼠在第1天、第8天腹腔注射致敏液，致敏液现配现用，配方为每1 ml无菌PBS中加入4%卵清蛋白粉末和1% Al(OH)3凝胶，对照组使用无菌PBS溶液做对照试验；在实验第15～20天每日固定时间对大鼠进行雾化吸入实验，每日30 min，对照组吸入无菌PBS溶液，哮喘组吸入现配现用的致敏液，雾化吸入的致敏液配方为1%卵清蛋白溶液。

1.2.2HE染色 将大鼠采用CO2窒息处死后，迅速取出两侧肺脏，用PBS冲洗干净后，予以4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，再脱水后进行石蜡包埋，最后切片和进行HE染色，观察对照组与哮喘组肺组织结构的差异。

1.2.3气管环的制备 克氏液需提前灭菌，并通入95% O2和5% CO2的混合气体。实验动物采用二氧化碳窒息法处死，解剖并尽快取出大鼠气管，取出的气管放入无菌克氏液中。借助解剖显微镜，切除气管周围的多余结缔组织后，将气管小心剪成气管环备用。

1.2.4气管组织转染 取所需体积的DEPC水于TRPP2 siRNA、siRNA NC干粉，配成转染保存液，并分装保存，防止因反复冻融对实验效率带来的影响。快速取出正常大鼠的气管环后，用无菌克氏液洗气管3遍后将气管放入12孔板中，每孔加入0.9 ml无血清高糖培养基。取Lipofectamine TM 3000 1 μl和Opti-MEM 49 μl混匀于离心管内，取配好的siRNA保存液5 μl和Opti-MEM 45 μl混匀于另一离心管内，室温将两支离心管静置5 min，然后将装有siRNA保存液加入含有Lip 3000的溶液中混匀，等待15 min后，将混合液以一定比例加入培养基中，放置在二氧化碳浓度为5%，温度恒定为37 ℃的环境中8 h。最后换入完全培养基，进行后续实验操作。

1.2.5离体气管张力实验 向浴槽中加入5 ml的克氏液，然后提前向其中通入混合气体，小心将气管环转移至气管张力实验仪器上，并及时浸泡在浴槽内，将气管环前负荷调整至1 g；张力换能器与实时记录数据的BL-420N系统连接，组织需在浴槽中稳定>40 min，克氏液每10 min换入新的。前负荷恒定时，加入高钾溶液来使气管环收缩。待收缩稳定并记录数值，再换入克氏液洗去高钾对气管带来的收缩效应，重复洗3次后，让气管浸泡于克氏液中平衡20～30 min。再加入卡巴胆碱和维拉帕米试剂，二者在克氏液中终浓度均为1 μmol/L，等待其收缩15～20 min并稳定，直接加入CaCl2溶液浓度梯度，记录气管收缩情况。

1.2.6Western Blot实验 加入合适量的裂解液，研磨组织制样，全程在冰上进行。研磨完成后为减少蛋白的降解，于4 ℃离心提取上清，煮样后获得蛋白样本。尽快使用蛋白样本进行电泳，采用湿法转膜，将含有蛋白的PVDF膜予以封闭。序贯进行一抗、二抗孵育后，用漂洗液洗去二抗，加入适量显影液，曝光并拍摄。

1.2.7免疫组化实验 取大鼠肺组织石蜡切片，加3%H2O2降低内源性酶对实验产生的影响，修复抗原，封闭，然后依次进行一抗、二抗孵育与DAB显色等[5]。棕黄色是阳性结果的表达，实验结果由Image-pro Plus 5.1软件进行数据分析。

1.3统计学方法 数据采用GraphPad分析软件统计，两组之间采用独立样本t检验进行显著性分析，若P<0.05则结果有统计学意义。

2 结果

2.1行为学改变 对照组大鼠未出现明显改变，哮喘组大鼠出现呼吸点头有明显声音、打喷嚏动作明显、不断抓鼻孔、腹肌有明显抽动等哮喘表现。

2.2HE染色 对照组大鼠肺部无炎症细胞聚集，无明显的炎症改变，肺泡完整，如图1A；哮喘组大鼠肺内有大量炎性细胞聚集，肺泡破裂不完整，如图1B。

图1 大鼠肺部苏木精-伊红(HE)染色结果(×100)

2.3SOCE引起的大鼠气管收缩在哮喘中的变化 相比于对照组大鼠，高钾所引起气管收缩的哮喘组大鼠中SOCE引起的气管收缩占的百分比明显增高(P<0.05)，见图2。

2.4TRPP2蛋白在哮喘组气管中表达变化 Western Blot实验结果见图3A、图3B，与对照组相比，哮喘组大鼠气管平滑肌组织TRPP2蛋白表达显著升高(P<0.05)。免疫组化结果也表明，相比对照组大鼠，哮喘组大鼠气管平滑肌细胞TRPP2蛋白表达量明显升高(见图3C、图3D)，结果差异有统计学意义(P<0.05)。

注：*表示P<0.05。

注：*表示P<0.05。

2.5TRPP2 siRNA转染后大鼠气管SOCE引起的收缩变化 TRPP2 siRNA转染正常大鼠气管后，Western Blot检测大鼠气管组织TRPP2蛋白含量，结果表明，转染组TRPP2蛋白含量明显低于转染对照组，如图4A所示。对转染后的气管环做气管张力实验，与转染对照组相比，SOCE引起的气管收缩占高钾引起收缩的百分比在转染组中明显降低(P<0.05)，结果如图4B所示。转染对照组与转染组高钾引起的气管收缩分别为(0.87±0.50) g和(0.84±0.38) g，结果无统计学意义(P>0.05)，表明转染后气管环的活力可维持后续检测。

3 讨论

哮喘的频繁发作会引起气管平滑肌增生，从而导致平滑肌收缩增强和气道变窄，最终引起气道高反应，如何控制哮喘时剧烈的气道收缩成为研究热点[6-7]。TRPP2由PKD2基因编码，在内质网膜中大量表达并充当钙释放通道，同时参与平滑肌收缩[8]。有研究发现，TRPP2在消化道平滑肌的表达与平滑肌的收缩具有相关性[9]。在本研究中，哮喘大鼠气管组织TRPP2蛋白表达明显升高，且免疫组化的实验结果表明，升高的TRPP2蛋白主要由于气管平滑肌的表达显著增高，这表明哮喘可以通过影响TRPP2蛋白在气管平滑肌中的含量参与哮喘的发生。

注：*表示P<0.05。

SOCE主要是由于细胞钙库中Ca2+缺乏，细胞外Ca2+流入细胞内，以弥补细胞内钙的缺乏。越来越多的研究表明，疾病时SOCE参与气道平滑肌细胞增殖和炎症的发生[10-11]。在本实验中，通过将离体气管环孵育在无钙的克氏液中，并加入卡巴胆碱和维拉帕米排空细胞内钙，最后加入CaCl2溶液梯度引起气管收缩，此时的收缩即为SOCE介导的钙离子内流。实验结果表明，哮喘大鼠气管平滑肌有更强的SOCE。为进一步探究TRPP2蛋白与SOCE通道的相关性，本研究对正常大鼠的离体气管组织转染TRPP2 siRNA以敲低气管组织中TRPP2蛋白的表达，敲低后的气管环相比转染siRNA NC的对照组SOCE明显降低，表明TRPP2蛋白会影响气管组织的钙离子内流。同时TRPP2 siRNA转染后通过Western Blot法检测也证实气管组织中TRPP2蛋白显著降低，达到了敲低TRPP2的目的，而且也没有显著影响高钾溶液引起的气管收缩，说明siRNA转染对气管活力影响不大。

综上所述，大鼠气道平滑肌TRPP2的表达改变可能会通过SOCE引起气管收缩功能变化。此发现可提供给哮喘治疗新的有效治疗途径与药物作用靶点。