miRNA-506在三阴性乳腺癌中的表达及对其增殖和侵袭作用的研究 *

汪进城，张磊，许培权2，祝景伟3，张杰

(1. 蚌埠医学院第二附属医院肿瘤外科，安徽 蚌埠 233000；2. 蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科，安徽 蚌埠 233099；3. 蚌埠医学院研究生院，安徽 蚌埠 233030)

乳腺癌是一种高发且长期困扰女性生命健康的恶性肿瘤，据2020年全球癌症统计显示，乳腺癌在女性恶性肿瘤新发病例占所有女性新发肿瘤疾病的30%左右，其致死率位于第二位，且乳腺癌的发病率逐年增加。三阴性乳腺癌(tripele negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌的亚型之一，是孕激素受体基因、雌激素受体基因以及人类表皮生长因子受体2基因均缺失的一类乳腺癌[1]。相比于其他亚型，TNBC亚型的乳腺癌具有极高的复发性、耐药性以及转移性等特点，导致乳腺癌患者有较低的中位生存率和总生存率[2]。目前中国范围内2020年有超过42万例女性患者，尽管化疗、手术治疗是TNBC的标准治疗方案，相比于其他乳腺癌类型，三阴性乳腺癌具体的发病机制仍不十分清楚，迫切需要更多的研究来阐明乳腺癌的发病机制，为寻找新的乳腺癌的诊断及治疗提供新策略。

众多研究学者发现微小RNA(microRNA，miRNA)在肿瘤的发生、耐药以及侵袭等过程占据着重要作用。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的内源性单链RNA分子。既往研究显示miRNA可参与肿瘤细胞增殖、分化、代谢及凋亡等生物学过程[3]。随着研究的深入，学者们发现miRNA-506是miRNA调控当中的一个关键miRNA，miRNA-506通过调控不同的靶基因之间的结合，从而抑制或者促进某些靶基因的表达，表现为在不同类型的肿瘤(卵巢癌、肺癌等)的微环境发挥抑癌基因的功能[1，4]，在肿瘤增殖和侵袭方面发挥着极为重要的作用。然而，有关miRNA-506在TNBC的研究报道极少。本研究旨在探讨miRNA-506在TNBC中的表达及对其增殖和侵袭作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1组织来源 所有收集的患者标本手术前均确诊为TNBC，患者均未接受化疗、放疗等治疗，获得乳腺癌患者的知情同意书，并通过蚌埠医学院伦理委员会的审批。乳腺组织标本来自蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科和蚌埠医学院第二附属医院肿瘤外科2019年10月—2021年6月接受手术切除治疗的TNBC患者的手术标本及取自距离TNBC组织边缘≥5 cm且与肿块不在同一象限的癌旁组织各100例，再取乳腺纤维腺瘤组织100例，将所取术后TNBC组织及配对的癌旁组织、乳腺良性病变组织一部分迅速放置于液氮保存，另一部分行常规免疫组化。

1.1.2细胞来源 人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞系HBL-100细胞均购自上海科学院上海细胞库。

1.1.3主要试剂材料 逆转录试剂盒购自日本Takara公司(批号：RR037A)；Real-time PCR试剂盒、PureLinkTMRNA小提试剂盒均购自美国赛默飞公司(批号：4371435，12183016)；CCK8试剂盒购自北京索莱宝公司(批号：CA1210)；Lipofect amine 2000 reagent 购自美国Invitrogen公司(批号：11668030)；Transwell小室购自美国corning(批号：CLS3470)。

1.1.4主要仪器 实时荧光PCR仪购自美国Bio-Rad公司；多功能酶标仪购自美国ThermoFisher公司；荧光倒置显微镜购自日本 OLYMPUS 公司；CO2恒温细胞培养箱购自美国ThermoFisher公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞和人正常乳腺上皮细胞系HBL-100细胞使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃，5%CO2以及湿度保持在95%的恒温恒湿无菌细胞培养箱内，MDA-MB-231细胞为贴壁细胞，生物安全柜内用胰酶消化液处理消化细胞，每隔1 d传代1次。

1.2.2实时荧光定量PCR 按照RNA快速提取试剂盒说明书从收集的TNBC组织、乳腺良性病变组织以及癌旁组织样本提取总RNA，紫外分光光度仪测定RNA溶液OD260nm/OD280nm的吸光度值，计算RNA的纯度和浓度，按照逆转录试剂盒说明书的步骤将定量的总RNA逆转录合成cDNA，采用10 μl逆录转反应体系：RNA sample 5.0 μl，Prime Script RT Enzyme Mix I 0.5 μl，RT Primer 0.5 μl，5×Prime Script Buffer2 2.0 μl，RNase Freed H2O 2.0 μl，37 ℃条件下反应15 min，85 ℃条件下5 s，反应产物4℃条件下保存，接着使用Real-time PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，所有反应均设立3个复孔，每孔采用10 μl反应体系：2×SYBR Green 5 μl，Primer mix 0.8 μl，DNase-free Water 3.7 μl ，RT product 0.5 μl。相对表达量采用2-△△Ct法计算。其中miRNA-506上游引物：5′-TGCGGTAAGGCACCCTTCTGAGTAG-3′，下游引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miRNA-506 mimics上游引物：5′-TAAGGCACCCTTCTGAGTAGA-3′，下游引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6上游引物：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。上述引物设计与合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.3细胞转染实验 取对数生长期的人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人正常乳腺上皮细胞系HBL-100细胞消化后，接种于6孔板中等待细胞贴壁，融合密度约70%，随后进行转染。倒掉6孔板中的旧培养基，转染期间使用opti-MEM进行培养，按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书对乳腺癌细胞进行转染，分别设置 NC组、miRNA-506 mimics组。转染6 h后，更换成正常的10%胎牛血清DMEM培养基，总共培养48 h后进行下面的操作。

1.2.4CCK8检测乳腺癌细胞增殖 将对数期生长期的MDA-MB-231细胞悬液以每孔1×105个/毫升细胞接种于96孔培养板中 ，每组设3个复孔，放置于细胞培养箱中培养12 h。根据1.2.3操作转染细胞，继续MDA-MB-231细胞培养12 h、24 h、48 h，每孔加10 μl 的CCK-8试剂溶液后，继续培养1.5 h。酶联免疫检测仪在450 nm波长下测定其吸光度。

1.2.5Transwell检测细胞侵袭 取经过1.2.3操作转染后的细胞，将各组不同处理的细胞使用胰蛋白酶消化液处理，将其制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/毫升，每组设立3个复孔。细胞接种到铺着Matrigel胶的Transwell小室的上室，600 μl的10%胎牛血清的RPMI 1640培养基放在下室，放入培养箱中培养48 h。吸走上室中的培养液，用棉签小心擦去多余的Matrigel胶和未迁移的细胞，加入无水甲醇固定25 min，然后结晶紫溶液染色25 min，在显微镜下观察。

2 结果

2.1TNBC组织中miRNA-506表达水平 如图1所示，与正常癌旁组织相比，TNBC癌组织miRNA-506表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，乳腺良性病变组织miRNA-506表达无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。

注：与癌旁组织相比，**P<0.01。

2.2TNBC细胞系miRNA-506表达水平 如图2所示，与正常乳腺上皮细胞系HBL-100组相比，TNBC细胞系MDA-MB-231组miRNA-506表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：与HBL-100组相比，**P<0.01。

2.3miRNA-506对TNBC细胞增殖的影响 如表1所示，与转染miRNA-506 NC组相比，转染miRNA-506 mimics组12 h、24 h、48 h组细胞活力(OD值)显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 两组细胞活力比较

2.4miRNA-506对TNBC细胞侵袭的影响 如图3所示，与转染miRNA-506 NC组相比，转染miRNA-506 mimics组48 h细胞侵袭率显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：与miRNA-506 NC组相比，**P<0.01。

3 讨论

随着各国学者对miRNA诱导的转录后调控肿瘤生物学行为的研究已经愈演愈烈，miRNA在癌症发生、发展、耐药等方面的研究已成为热点。在肿瘤微环境下，miRNAs控制人类二分之一基因的miRNA表达进而调控着抑癌基因和促癌基因。最近的miRNA研究集中在各种高通量生化筛选上，这些筛选可测量1000多种人类miRNA在人类癌症中的表达。数百个miRNA 被定位到癌症基因组中的改变区域。miRNAs在发育过程中的正常干细胞功能中也起着关键作用，并已成为癌症干细胞的重要调节因子[5]。研究表明，使用miRNA替代或抗miRNA技术对癌细胞中特定miRNA改变的调节可恢复miRNA活性并修复影响凋亡信号通路或药物敏感性的基因调控网络，并改善治疗结果[6]，miRNA的过表达或缺失在驱动人类癌症的发生和发展过程中扮演着重要的角色。

miRNA-506定位于X染色体。迄今为止，对miRNA-506的研究很少，因此对其在恶性肿瘤发生发展中的作用仍知之甚少。在非小细胞肺癌A549细胞中miRNA-506能够通过Bax/Bcl-2/MCL-1途径抑制细胞上皮间质转化，促进凋亡[7]。此外，miRNA-506可以通过抑制 PPARa表达来诱导直肠癌细胞对羟基喜树碱的抗性[8]。上述研究表明miRNA-506在肺癌和结直肠癌环境中充当肿瘤抑制基因。然而，在黑色素瘤患者中miRNA-506的高表达与黑色素瘤的恶性程度呈正相关，抑制miRNA-506表达可显著抑制黑色素瘤细胞的增殖，降低其侵袭性和集落形成能力[9]，表明miRNA-506可以充当促癌基因。综合以上研究

表明miRNA-506在不同的肿瘤中可能扮演不同的角色，其原因可能与癌症的病理分期以及肿瘤类型密切相关。新近研究通过功能蛋白质组学在多个细胞系中筛选miRNA文库并整合来自乳腺和卵巢肿瘤的数据，结果发现miRNA-506能够逆转肿瘤抑制因子如 p27/myc/phospho-Rb 蛋白[10]。

本研究发现miRNA-506在TNBC中的表达较低，以及过表达TNBC细胞内的miRNA-506可以抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭、迁移，丰富了miRNA-506在TNBC细胞方面认识，为未来靶向miRNA-506提供理论基础。