β-葡聚糖酶降解黑木耳多糖工艺研究

吴迪，王旭升，于特，曹慧馨，赵竞，吴琼*

（1.长春大学 食品科学与工程学院，吉林 长春 130022；2.长春市十一高中，吉林 长春 130000）

黑木耳（Auricularia auricula）又称为黑菜、桑耳，木耳科木耳属真菌[1]，是一种具有价值的食用菌[2]，其中的黑木耳多糖具有抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、降血脂、降血糖等多种生物活性[3]。但天然的黑木耳多糖分子量大、形成的溶液黏度较大[4-5]，不利于黑木耳多糖的进一步开发及利用，因此，将高分子量的黑木耳多糖降解成低分子量且溶解黏度小的酶解多糖[6]，对黑木耳多糖的应用具有重要意义。研究表明，酶解后多糖的生物活性会得到明显的提高[7]，多糖酶解主要是通过改变多糖的分子结构、分子质量、溶解度及取代基的种类、数量以实现其理化性质的改变、生物活性的增强等效果[8-9]。

黑木耳多糖主要由水溶性β-D-葡聚糖、水不溶性β-D-葡聚糖和2种酸性杂多糖构成[10-11]，且两种β-D-葡聚糖都是由β-1，3-糖苷键连接而成。β-葡聚糖酶（β-glucanase） 是可降解 β-1，3-糖苷键、β-1，4-糖苷键的水解酶，可使多糖改性增溶[12-13]，基于此，本试验将β-葡聚糖酶作为外源酶酶解黑木耳多糖，并通过调节加酶量、酶解pH值、酶解时间和酶解温度进行试验，降低黑木耳多糖的分子量[14]，得到最佳降解效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳：市售；氢氧化钠、柠檬酸：北京化工厂；3-5二硝基水杨酸：国药集团化学试剂有限公司；β-葡聚糖酶（20 000 U/g）：河南万邦实业有限公司；溴化钾：天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（SPD-20A）：岛津仪器（苏州）有限公司；红外光谱仪（NICOLET iS5）：赛默飞世尔科技有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：巩义市予华仪器有限责任公司；医用离心机（3K15）：曦玛离心机有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑木耳多糖的提取

称取黑木耳粉末40 g，采用水提醇沉法对黑木耳多糖进行提取[15-16]，以料液比 1∶10（g/mL）加入 80%的乙醇溶液，70℃下浸提2次，每次2 h，将滤渣60℃烘干，以料液比1∶30（g/mL）称取滤渣并加入蒸馏水，90℃下浸提2次，每次4 h，3 500 r/min离心20 min得上清液，旋转蒸发至原体积的1/4，所得的浓缩溶液即为黑木耳粗多糖。向浓缩溶液中加入三氯乙酸，4℃冰箱中静置24 h，4 000 r/min离心20 min得黑木耳多糖[17]，加入4倍体积的无水乙醇，将其放入4℃冰箱中静置24 h，8 000 r/min离心20 min，所得沉淀冻干，得黑木耳多糖[18]。

1.3.2 黑木耳多糖的降解

取100 mL 10 mg/mL黑木耳多糖溶液，通过添加柠檬酸或 NaOH 调节酶解 pH 值 4.4、4.8、5.2、5.6、6.0，按加酶量 300、500、700 、900、1 100 U/g分别添加至配制好的多糖溶液中，在酶解温度 10、20、30、40、50℃，酶解时间 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 下，测定筛选最佳反应条件。

在最佳工艺条件下制备黑木耳酶解多糖，通过添加柠檬酸或NaOH将黑木耳多糖溶液的pH值调至5.2，按加酶量700 U/g加入β-葡聚糖酶，置于30℃恒温振荡水槽中反应2 h，反应后沸水浴10 min灭活β-葡聚糖酶，6 000 r/min离心5 min，加入4倍体积无水乙醇，将其放入4℃冰箱中静置24 h，8 000 r/min离心20 min，所得沉淀冻干，得黑木耳酶解多糖。

1.3.3 还原糖生成量测定

量取0.5 mL离心后的上清液放入试管中，加入1.5 mL二硝基水杨酸试剂，沸水浴5 min，加蒸馏水定容至10 mL。于540 nm处测定吸光度，3次平行试验，通过下式计算还原糖生成量。

1.3.4 溶解率的测定

取酶解前后的黑木耳多糖10 mg于EP管中，充分溶解，在8 000 r/min离心10 min，除去上清液，在50℃下烘至完全干燥，称重，通过下式计算溶解率。

1.3.5 多糖的结构分析

1.3.5.1 分子量测定

将样品配制成5 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤后取20 μL溶液进样。根据标准曲线计算样品分子量。采用高效液相色谱对酶解前后黑木耳多糖的分子量进行测定，分子量标准曲线如图1所示。

图1 分子量测定标准曲线Fig.1 Standard curve for molecular weight determination

以RID-10A示差折射检测器，不锈钢色谱柱7.8 mm×300 mm，柱温为35℃，流动相为超纯水，流速为0.5 mL/min，分子量标准曲线的绘制以保留时间为横坐标，以标准葡聚糖的分子量对数（lgMw）为纵坐标，得标准曲线 y=-0.191 4x+0.951 8，R2=0.995 4。

1.3.5.2 红外光谱测定

在相对干燥环境下，取1 mg样品与0.18 g溴化钾混合研磨均匀，压片，在波段400 cm-1～4 000 cm-1处进行红外光谱扫描[19]，检测样品中是否存在多糖的特征吸收峰。

1.3.5.3 紫外-可见光谱分析

用去离子水配制浓度为0.3 mg/mL的β-葡聚糖酶解黑木耳多糖溶液，以去离子水作为空白对照，在200 nm～800 nm内进行紫外全波段扫描，检测样品中是否具有核酸和蛋白质的特征吸收峰。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 加酶量对还原糖生成量的影响

加酶量对还原糖生成量的影响如图2所示。

图2 加酶量对黑木耳多糖降解效率的影响Fig.2 Effect of enzyme dosage on the degradation efficiency of Auricularia auricula polysaccharide

还原糖生成量随加酶量增加先增大后减小，这是由于当加酶量大于一定值后，底物被充分利用，还原糖生成量不再增多，如果继续增加β-葡聚糖酶的量会导致酶之间出现相互附着的情况，降低了酶与底物之间的作用效果，导致酶不能更好地分解黑木耳多糖，因此，在以还原糖的生成量为参考指标时，最适加酶量在300 U/g～700 U/g。

2.1.2 酶解pH值对还原糖生成量的影响

酶解pH值对还原糖生成量的影响如图3所示。

图3 酶解pH值对黑木耳多糖降解效率的影响Fig.3 Effect of pH value on the degradation efficiency of Auricularia auricula polysaccharide

还原糖生成量会根据pH值的不同而变化，pH值过高或过低时还原糖生成量都较低，这是由于在多糖溶液中pH值大于或小于β-葡聚糖酶的最适pH值时，酶的活性被抑制，导致β-葡聚糖酶对黑木耳多糖分子的催化作用变弱，因此影响了β-葡聚糖对黑木耳多糖的降解效率。因此，酶解最适pH值在4.8～5.6。

2.1.3 酶解时间对还原糖生成量的影响

酶解时间对还原糖生成量的影响如图4所示。

图4 酶解时间对黑木耳多糖降解效率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on the degradation efficiency of Auricularia auricula polysaccharide

还原糖生成量随着酶解时间的增加先增大后趋于平缓，这是因为随着酶解时间的延长，底物的多糖溶液在β-葡聚糖酶的作用下不断减少，在2 h后底物被完全利用，曲线开始呈现平滑趋势，因此，确定最佳酶解时间在2 h～3 h。

2.1.4 酶解温度对还原糖生成量的影响

酶解温度对还原糖生成量的影响如图5所示。

图5 酶解温度对黑木耳多糖降解效率的影响Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on the degradation efficiency of Auricularia auricula polysaccharide

还原糖的生成量随着温度的升高，先上升后下降，这是由于在30℃之前，随着温度的升高，黑木耳多糖分子以及β-葡聚糖酶分子之间的运动速度加快，相互接触的机会增大[20]，使得反应速率加快，因此曲线呈快速上升的趋势，在30℃时达到最大值；当反应温度大于30℃时，β-葡聚糖酶由于吸收了过多热量，自身化学键不稳定[21]，发生断裂，最终导致酶活性降低甚至丧失，黑木耳多糖的降解效率也随之降低，因此，最适酶解温度在25℃～35℃。

2.2 正交试验

以单因素试验结果为依据，设计以加酶量、酶解pH值、酶解时间、酶解温度的正交试验。各因素水平设置如表1所示。

表1 正交试验设计Table 1 Orthogonal experimental design

极差分析结果表明，对β-葡聚糖酶活力影响的主次顺序：加酶量＞酶解pH值＞酶解时间＞酶解温度，最佳酶解条件为加酶量700 U/g，酶解pH值5.2，酶解时间2h，酶解温度30℃，即最优参数组合为A3B3C2D1。通过验证试验，在最佳条件下，还原糖生成量为42.64 mg/g，证实正交试验结果可信。

2.3 溶解率

酶解前后黑木耳多糖干物质重分别为0.026 6、0.0243g，酶解前后黑木耳多糖的溶解率分别为37.96%、41.56%，酶解前后黑木耳多糖溶解率提高了3.6%。

2.4 分子量分析

酶解前后黑木耳多糖分子量图谱如图6所示。

图6 酶解前后黑木耳多糖分子量图谱Fig.6 Molecular weight map of Auricularia auricula polysaccharide before and after enzymolysis

由图6可知，采用凝胶色谱法测定各标准样品的保留时间与分子量之间的关系，由图6可知，黑木耳多糖及其酶解多糖的保留时间分别是9.823、13.209 min，由标准曲线得出其分子量分别为131 300、3 388 Da，分析结果表明，酶解后黑木耳多糖保留时间延后，酶解前后分子量降低了127 912 Da，说明酶解对多糖分子量的降低具有很好的作用。

2.5 红外光谱分析

红外光谱扫描结果如图7所示。

图7 酶解多糖的红外光谱图Fig.7 Infrared spectrum of enzymolysis polysaccharide

由图7可知，黑木耳酶解多糖在3 404、2 929、1 729、1 622、1 375、1 250、1 038 cm-1的附近存在吸收峰，在3 404 cm-1处的强吸收是-OH的伸缩振动峰，在2 929 cm-1处的峰是CH3和-CH2-中C-H键的伸缩振动峰[22]，1 375 cm-1处的吸收峰为C-H键的变角振动，其与C-H的伸缩振动构成了糖环的吸收[23]，1 729 cm-1处的吸收峰表明多糖中含有糖醛酸，1 622 cm-1处的吸收峰是分子内氢键的特征峰[24]，在1 250 cm-1处的振动是由于O-H的拉伸和振动造成的，可以推断，黑木耳酶解多糖具有多糖的特征吸收峰[25]。

2.6 紫外-可见光谱分析结果

紫外光谱扫描结果如图8所示。

图8 酶解前后黑木耳多糖的紫外全波段扫描图Fig.8 UV scanning of Auricularia auricula polysaccharide before and after enzymolysis

由图8可知，最大吸收峰比较集中，黑木耳多糖的成分较为单一，吸收峰主要在250 mm～280 nm，说明酶解前后的黑木耳多糖可能含有少量的蛋白质或核酸等成分[26-27]。

3 结论

本研究以水提醇沉法提取黑木耳多糖，并用β-葡聚糖酶酶解，得酶解最佳条件，即在加酶量700 U/g、酶解pH值5.2、酶解时间2 h、酶解温度30℃的条件下，得到的还原糖生成量为42.64 mg/g，并对酶解前后样品的溶解率、分子量、红外光谱以及紫外全光谱进行测定，对黑木耳多糖酶解前后的结构进行表征，酶解前后黑木耳多糖的溶解率分别37.96%、41.56%，酶解后溶解率提高了3.6%，说明酶解使黑木耳多糖的溶解率得到提高；酶解前后的黑木耳多糖分子量分别为131 300、3 388 Da，酶解后分子量降低了127 912 Da，表明酶解有效降低了黑木耳多糖的分子量；通过FTIR分析发现，酶解前后黑木耳多糖的主要吸收峰没有变化，说明酶解对黑木耳多糖的主要结构没有影响。研究表明，将黑木耳多糖从高分子量降低成低分子量，可以提高其生物活性，并且低分子多糖更易被人体吸收，因此，本项研究对黑木耳多糖降解工艺的研究具有一定的推动作用。