脑蛋白水解物-Ⅰ对D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用

王圆明 倪钦帅 安康 于曦 朱琳

[摘要] 目的 探討脑蛋白水解物-Ⅰ（CH-Ⅰ）对D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用。方法 将32只C57小鼠随机分为对照组、模型组、CH-Ⅰ低剂量组（3 mg/kg）和CH-Ⅰ高剂量组（6 mg/kg），模型组及CH-Ⅰ组小鼠颈背部皮下注射D-半乳糖150 mg/kg，对照组小鼠颈背部皮下注射等量生理盐水，注射3周后，给药组小鼠腹腔注射相应剂量的CH-Ⅰ，对照组及模型组小鼠腹腔注射等量生理盐水，持续给药5周后，进行老化度评分和旷场实验。比色法检测小鼠海马组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量。尼氏染色观察小鼠海马区神经元损伤。 结果 与对照组相比，模型组小鼠的老化度评分明显增高（P<0.01），自主活动和探索行为减弱，海马组织中SOD、GSH-Px活性明显降低（P<0.01），MDA含量显著增加（P<0.01），海马CA1区神经元显著损伤。经CH-Ⅰ治疗后，可显著降低衰老小鼠的老化度评分（P<0.05，P<0.01），提高小鼠的自主行为能力，提高海马组织中SOD、GSH-Px活性（P<0.05，P<0.01），减少MDA含量（P<0.05，P<0.01），改善海马组织CA1区神经元损伤。结论 CH-Ⅰ可以有效改善D-半乳糖模型小鼠的老化程度和自主行为，提高海马组织的抗氧化能力，减少海马神经元损伤。

[关键词] 脑蛋白水解物-Ⅰ;D-半乳糖;衰老;C57小鼠;海马

[中图分类号] R965          [文献标识码] A&nbsp;         [文章编号] 1673-9701（2022）05-0030-04

[Abstract] Objective To investigate the anti-aging effect of cerebroprotein hydrolysate-Ⅰ（CH-Ⅰ） on D-galactose-induced aging mice. Methods A total of 32 C57 mice were randomly divided into the control group， the model group， the CH-Ⅰ low-dose group （3 mg/kg） and the CH-Ⅰ high-dose group （6 mg/kg）. The model group and the two CH-Ⅰ groups were injected with 150 mg/kg D-galactose subcutaneously on the back of the neck. The control group were injected with the same amount of normal saline subcutaneously on the back of the neck. At 3 weeks after injection， the two CH-Ⅰ groups were injected intraperitoneally with the corresponding dose of CH-Ⅰ， and the control group and the model group were intraperitoneally injected with the same amount of normal saline. After continuous administration for 5 weeks， the aging degree scoring and open field experiment were performed. Colorimetric method was used to detect superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px） activity and malonaldehyde （MDA） content in hippocampal tissue. Nissl staining method was used to observe neuronal damage in hippocampus. Results Compared with the control group， the aging score in the model group was significantly increased （P<0.01）， autonomous activities and exploratory behaviors were weakened， SOD and GSH-Px activities in hippocampus tissue were significantly reduced （P<0.01）， MDA content was significant increased（P<0.01）， and neurons in CA1 area of hippocampus were significantly damaged. CH-Ⅰ treatment significantly reduced aging score of aging mice （P<0.05，P<0.01）， improved autonomous activities， increased SOD and GSH-Px activities in hippocampus （P<0.05，P<0.01）， reduced MDA content （P<0.05，P<0.01）， and improved neuron damage in CA1 area of hippocampus. Conclusion CH-Ⅰ can effectively improve aging score and autonomous activities of D-galactose model mice， improve antioxidant capacity of hippocampal tissue， and reduce neuron damage of hippocampus.

[Key words] Cerebroprotein hydrolysate -Ⅰ; D-galactose; Aging; C57 mice; Hippocampus

衰老是大多数神经退行性疾病的主要危险因素，伴随衰老常出现神经元损伤，特别是海马区神经元损伤，并最终导致认知和自主行为障碍[1]。目前，对于衰老相关的神经退行性疾病（如老年性痴呆和帕金森病）尚缺少特效的治疗方法，这些疾病往往以不可逆转的方式发展，并造成巨大的社会和经济负担[2]。衰老相关的神经元损伤涉及复杂的细胞和分子过程，包括氧化应激、炎性损伤、细胞凋亡、自噬等[3]。其中，氧化应激是海马神经元衰老和行为能力下降的重要原因，在许多神经退行性疾病中，神经元内氧化应激升高是普遍存在的[4]。脑蛋白水解物-Ⅰ（cerebroprotein hydrolysate-Ⅰ，CH-Ⅰ）是从猪脑组织中提取的低分子量神经肽类混合物，具有类神经营养因子的作用[5]。在体内，CH-Ⅰ已被证明可以促進神经发生，减轻神经炎症，抑制自由基的形成，具有神经保护作用[6-7]。本课题组前期研究提示，CH-Ⅰ可以通过提高端粒酶活性而延缓D-半乳糖诱导PC12细胞的衰老损伤，减轻D-gal诱导小鼠海马组织的衰老损伤[8]。但目前关于CH-Ⅰ对衰老小鼠氧化应激方面的影响尚不十分清楚。因此，本研究通过建立D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型，观察CH-Ⅰ抗小鼠衰老的作用和可能的机制。

1  材料与方法

1.1  材料来源

SPF级雄性8周龄C57/BL 6N小鼠32只，体重（21±3）g，购于北京维通利华实验动物技术公司（SCXK2016-0006）。注射用脑蛋白水解物-Ⅰ（CH-Ⅰ）购于河北智同生物制药公司（0190501-1，30 mg/支），D-半乳糖（D-galactose，D-gal）购于上海阿拉丁试剂公司（K1915124，纯度≥99%），尼氏染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司。本实验符合青岛大学医学部医学伦理委员会审批（伦审批件号：WZLL26128）

1.2  动物分组及处理

C57小鼠32只，饲养于SPF级动物室，自由饮食，适应性饲养1周后，将小鼠随机分为对照组、模型组、CH-Ⅰ低剂量（CH-ⅠL）组、CH-Ⅰ高剂量（CH-ⅠH）组，每组各8只。除对照组外，各小鼠颈背部皮下注射150 mg/kg D-gal，对照组小鼠颈背部皮下注射等量生理盐水，1次/d，持续8周。D-gal注射3周后，CH-Ⅰ低剂量组、高剂量组小鼠分别腹腔注射CH-Ⅰ3 mg/kg和6 mg/kg，对照组、模型组小鼠分别腹腔注射等量生理盐水，1次/d，持续5周。实验过程严格遵守动物伦理学要求，动物全部存活，无死亡或脱失。

1.3  老化度评分

给药结束后，参考既往文献的老化度评分标准，从反应性、皮毛光泽、皮毛粗糙程度、脱毛程度、皮肤溃疡等指标，对小鼠进行客观评分，积分越高表明老化度越高[9]。

1.4  旷场实验

给药结束7 d后，使用旷场实验检测小鼠的自主活动和探索行为。每只小鼠放置于旷场中相同角落并面向墙壁，随后小鼠自由活动5 min，录像系统记录小鼠的行为活动。每只小鼠实验结束后擦拭干净，避免留下气味和污物。

1.5  氧化应激指标检测

每组随机选取4只小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经心脏灌注生理盐水，完整取脑，冰上分离海马组织，按照99：1比例加RIPA裂解液，匀浆器研磨，10 000 rpm离心5 min，取上清液（即蛋白提取液）置于EP管中。再次加入0.5～1.0倍的RIPA裂解液，重复离心1次，获得蛋白提取液，BCA法测定蛋白浓度，-80℃保存。根据试剂盒的说明，使用比色法检测SOD（四氮唑-8，WST-8法）、GSH-Px活性（还原型辅酶Ⅱ，NADPH法）和MDA（硫代巴比妥酸，TBA法））含量，分别以U/mg、U/mg和μM/mg表示。

1.6  尼氏染色

旷场实验结束后，每组随机选取4只小鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，经心脏依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛，完整取脑。脑组织常规梯度脱水、石蜡包埋，海马区连续冠状切片。切片常规脱蜡至水后，置于含焦油紫染液的染色缸中，于56℃温箱中1 h，双蒸水冲洗2 min。随后将切片于尼氏分化液中分化1 min，常规脱水、透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察海马CA1区染色情况，每张切片随机选取5个不重叠的高倍（400×）视野观察神经细胞尼氏小体的形态结构。

1.7  统计学分析

应用Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分析。计量资料以（x±s）表示。多组间的数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD -t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  CH-Ⅰ对小鼠老化度评分的影响

老化度评分结果显示，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的老化度评分明显增高（P<0.01）。而给予CH-Ⅰ处理后，CH-ⅠL组和CH-ⅠH组的老化度评分较模型组小鼠均明显降低（P<0.05，P<0.01），CH-ⅠL组、CH-ⅠH组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2  CH-Ⅰ对小鼠自主行为能力的影响

旷场实验结果显示，模型组小鼠在5 min内站立次数较对照组显著减少（P<0.01），说明小鼠的自主活动能力减弱，且模型组小鼠在中央区的运动时间和距离缩短（P<0.01），小鼠的探索能力减弱。给予CH-Ⅰ处理后，CH-ⅠL组和CH-ⅠH组的小鼠站立次数较模型组明显增加（P<0.05，P<0.01），在中央区的运动时间和距离明显延长（P<0.05，P<0.01），CH-ⅠL组、CH-ⅠH组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05），说明CH-Ⅰ可以提高小鼠的自主行为能力。见表2、图1。

2.3  CH-Ⅰ對小鼠海马组织中氧化应激损伤的影响

与对照组相比，衰老模型组小鼠的海马组织中SOD和GSH-Px活性显著下降（P<0.01），MDA含量显著增加（P<0.01），说明衰老小鼠海马组织的氧化应激损伤明显增加。给予药物治疗后，CH-ⅠL组和CH-ⅠH组小鼠的海马组织中SOD和GSH-Px活性均有升高（P<0.05，P<0.01），MDA含量均明显降低（P<0.05，P<0.01），而CH-ⅠL组、CH-ⅠH组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05），表明CH-Ⅰ能显著提高小鼠海马组织中抗氧化能力。见表3。

2.4  CH-Ⅰ对小鼠海马CA1区神经元损伤的影响

对照组小鼠海马CA1区的尼氏小体较多，排列整齐，广泛分布;模型组小鼠海马CA1区的尼氏小体明显减少，排列紊乱，分布稀疏，说明海马神经元出现损伤。给予CH-Ⅰ治疗后，CH-ⅠL组和CH-ⅠH组小鼠的尼氏小体较模型组均有明显增加，排列整齐，分布均匀，说明CH-Ⅰ可以改善衰老小鼠海马区神经元的病理状态。见封三图6。

3  讨论

衰老是一个不可避免的复杂生物过程，主要是指生物结构的改变和各种因素导致的功能退化[10]。伴随衰老常常会出现认知、自主行为能力的下降，而海马组织与自主行为功能密切相关，在人类和动物中，海马组织特别容易受到衰老的影响[11]。近年来，天然活性产物在衰老中的应用已成为一个热门话题[12]。CH-Ⅰ是一种从猪脑组织中提取的神经肽类物质，用于治疗血管性痴呆、创伤性脑损伤、脑卒中和阿尔茨海默病，具有一定的神经营养和神经保护作用[13-14]。但CH-Ⅰ对D-gal诱导的小鼠自主行为障碍和神经损伤的影响尚不明确。因此，本研究探讨CH-Ⅰ对D-gal诱导的衰老模型小鼠的作用。

D-gal是乳糖的主要成分，在糖代谢中起到代谢作用。然而，D-gal的过度积累会导致代谢紊乱，最终导致衰老[15]。本研究结果表明，给予D-gal处理后，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的反应性、皮毛光泽、脱毛程度、皮肤溃疡等老化度评分明显增加。此外，D-gal显著降低小鼠的自主活动和探索行为能力。给予不同剂量的CH-Ⅰ（3、6 mg/kg）治疗后，衰老小鼠的老化度评分明显降低，自主活动和探索行为增加。尼氏小体可以反映神经元的损伤情况，当神经元受到损伤时，尼氏小体减少甚至消失，而在损伤恢复过程中，尼氏小体又重新增多[16]。本实验利用尼氏染色观察海马组织中尼氏小体的分布情况，结果表明，模型小鼠海马组织CA1区的尼氏小体明显减少，而CH-Ⅰ可以增加衰老小鼠海马组织的尼氏小体数量，说明CH-Ⅰ可以减轻海马组织的神经元损伤。

氧化应激是导致细胞衰老的主要因素之一，既往研究表明，伴随衰老，海马神经元内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平增加，抗氧化能力下降，最终导致神经元衰老和死亡[17]。氧化损伤程度可以通过评估抗氧化酶（如SOD、GSH-Px）的活性和氧化损伤相关产物（如MDA）的含量确定[18]。大量研究表明，D-gal代谢产生的ROS会在大脑中积累，通过氧化应激造成脑组织损伤，进而引起神经生化变化和行为障碍，最终导致脑衰老[20]。Benito等[21]研究表明，增加BDNF和STAT3的磷酸化水平，可以促进神经再生，改善神经损伤，并通过增加BDNF的表达和磷酸化STAT3也可以改善大鼠的记忆缺陷。本课题组前期研究表明，CH-I可显著提高D-gal衰老小鼠海马组织中的BDNF表达水平[8]。本实验长期给予小鼠注射D-gal，增加小鼠海马组织中的氧化应激损伤，表现为海马组织中的SOD活性和GSH-Px活性显著降低，抗氧化功能减弱，而MDA含量增加，说明氧化损伤加重，与既往的实验结果一致[22-23]。本实验给予CH-Ⅰ干预后，衰老模型小鼠的海马组织中SOD、GSH-Px活性均显著增加，MDA含量显著降低，提示CH-Ⅰ可以提高海马神经元的抗氧化能力，从而减轻神经元衰老损伤，起到神经保护作用。

综上所述，CH-Ⅰ可有效降低衰老小鼠的老化度评分，改善衰老小鼠的自主行为障碍，减轻衰老小鼠的海马神经元损伤，这可能是通过提高海马神经元抗氧化能力，减轻氧化应激损伤实现的。

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（收稿日期：2021-08-03）