草珊瑚活性成分提取及含量测定方法研究

王忠伟，黄安香，杨守禄，邬能英，柏文恋，李丹

(贵州省林业科学研究院，贵州 贵阳 550005)

草珊瑚为金粟兰科植物(SarcandraglabraThunb.Nakai)，又名肿节风、接骨木、接骨草、九节茶、九节兰等，生于山谷林下阴湿处，主要分布于我国福建、江西、广西及贵州等地[1-3]。草珊瑚主要含有香豆素、有机酸、黄酮、挥发油类等化学成分，其性味苦、辛、平，具有清热凉血、活血祛斑、祛风通络等功效[4-5]。段营辉等在研究草珊瑚的化学成分时分离出10个化合物，分别鉴定为嗪皮素、异嗪皮啶、槲皮素-3-氧-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-氧-葡萄糖醛酸苷、绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸、迷迭香酸-4-氧-葡萄糖苷、异香草酸、β-hydroxypropiovanillone[6]。草珊瑚中具有抗菌活性化学成分的香豆素是草珊瑚的活性成分[7-9]。此外，郑冬梅等利用气质色谱法分析草珊瑚挥发油，发现含有柠檬烯，芳樟醇，乙酸龙脑酯，β-榄香烯等化合物。可见，草珊瑚的活性成分研究比较多[10]。但草珊瑚的质量控制主要依据2015版《中华人民共和国药典》，药典规定了HPLC法测定草珊瑚异嗪皮啶与迷迭香酸[11]，采用加热回流方式进行提取，提取过程复杂，耗时长。本研究采用甲醇为提取溶剂，比较了3种提取方法对草珊瑚中绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的影响，其中超声提取具有耗时短、操作简单、提取效率高、可以同时提取多个样品等优点，利用150 mm的分离短柱将三者分离，检测时间短，检测效率高，建立了简单高效的草珊瑚中绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸含量测定方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱系统，包括二极管阵列检测器，四元泵溶剂系统，自动进样器，柱温箱，Chemstation工作站；色谱柱(150 mm × 4.6 mm，4 um) (美国Agilent公司)

绿原酸标准品(纯度>99.48%)、异嗪皮啶标准品(纯度>98.241%)、迷迭香酸标准品(纯度>99.685%)均购置于成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)；水(超纯水，娃哈哈公司)；磷酸(HPLC级，天津科密欧公司)。两年生草珊瑚整株鲜样，采自贵州省丛江、榕江两地。

表1 样品采集信息

1.2 色谱条件

高效液相色谱二极管阵列(HPLC-DAD)，反相色谱柱：150 mm× 4.6 mm，4μm，色谱柱温度设为40 ℃。流动相：梯度洗脱(0～9 min，20%A+80%B，10～15 min，40%A+60%B)，流速0.6 mL/min，进样量10 μL，采用吸收波长344 nm，检测绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸3个物质。总进样时间为15 min，该色谱条件下，3个成分的色谱峰分离较好，绿原酸保留时间3.278 min，异嗪皮啶保留时间7.981 min，迷迭香酸保留时间11.432 min。

1.3 标准品溶液的制备

精密称取绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸各标准品0.01 g。分别用甲醇溶解后，定容至10 mL，再取1 mL定容到10 mL，得到每1 mL含绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸100 μg的标准品储备液。

1.4 各标准品曲线的绘制

分别从绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸标准品储备液中准确移取一定体积于容量瓶中，配制成绿原酸、异嗪皮啶0.5、1、5、10、20 μg/mL；迷迭香酸5、10、20、50、100 μg/mL系列混合标准溶液，按照1.2进行检测。

1.5 样品溶液制备

样品前处理：将采集的草珊瑚整株洗净后，100 ℃杀青1 h，80 ℃烘干至恒重，粉碎后过0.84筛，作为样品备用。称取草珊瑚样品1.0 g(0.0001)，置具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇，浸润0.5 h，50 ℃超声提取10 min。冷却至室温，过滤，稀释至适宜的倍数，过0.22 μm微孔滤膜，转移至进样瓶，待测。

2 研究内容与结果

2.1 色谱条件优化

流动相的选择对草珊瑚中绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的呈现起到了关键作用，用乙腈与纯水为流动相时，3个化合物分离度达不到1.5，并且峰型有拖尾的现象，而在纯水中加入磷酸可以达到较好分离效果[11-12]。为了较好的分离效果，往往选择较高的酸浓度，较长的色谱柱[13-15]，如用0.2%磷酸水与乙腈为流动相，250 mm长柱。流动相中磷酸比例越高，酸性越强，对色谱柱的腐蚀越严重，色谱柱越长，柱压会越高，所需平衡时间越长，导致迷迭香酸的保留时间达到55 min，造成了时间延长，流动相消耗多，色谱柱损坏加剧的现象[16]。为此，选用0.1%的磷酸水与乙腈为流动相(20∶80)，150 mm短柱，流速0.6 mL/min后，3个物质分离度达到1.5以上，绿原酸出峰时间为3.278 min、异嗪皮啶出峰时间为7.981 min。但是迷迭香酸依然出现拖尾，选用0.1%的磷酸水与乙腈(40：60)，无拖尾现象，能将目标峰与杂质峰分开，出峰时间为11.432 min，标样与实际样品谱图如下：

图1 标准样品图谱

图2 草珊瑚样品图谱

2.2 提取条件优化

2.2.1 提取方式

本文以活性成分回收率为研究指标，分析了超声提取、加热回流、震荡提取3种方法对草珊瑚中活性成分绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸回收率的影响，结果如图3所示。结果表明采用震荡法提取1 h，3者的回收率为15.6%、18.3%、21.3%，可见该法提取不完全，效率低。其可能的原因是活性成分易溶于热甲醇、乙醇、氯仿，室温提取过程中，由于温度低，导致活性成分未被提取充分[11]。加热回流法提取1 h，3者的回收率为97.3%、96.5%、98.4%，可见该法提取效果好，但是操作繁琐，耗时长，制约因素多，杂质干扰大[17]。40 KHZ超声波在50 ℃温度条件下提取10 min，3者回收率为98.1%、95.3%、97.2%，可见超声提取效率高、步骤少、操作简单[17]。由此可见，超声提取不失为草珊瑚中活性成分提取的好方法。

图3 提取方法对草珊瑚中绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸回收率影响

2.2.2 超声提取条件优化

超声(40 KHZ)提取在20、40、50 ℃的温度下，提取时间5、10、20、30 min，结果如图4。在50 ℃，10 min的条件下，效果最好，绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的回收率为98.1%、95.3%、99.2%。在较低温度(20、40 ℃)提取时，需要延长提取时间来达到更高的回收率。当温度上升到50 ℃，时间在10 min时回收率达到极值，继续提取，回收率反而降低，其原因可能是在50 ℃温度下，超声提取时间过长导致目标化合物分解。

图4 不同温度、时间超声提取草珊瑚中3成分回收率(A)室温，(B)40 ℃,(C)50 ℃。

2.3 方法的确定性与稳定性评价

2.3.1 标准曲线、基质效应和LOQ

精密吸取绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸单一成分标准储备液适量，用甲醇分别稀释成5个浓度的混合标准溶液，其中绿原酸、异嗪皮啶浓度为0.5、1、5、10、20 ug/mL，迷迭香酸浓度为5、10、20、50、100 ug/mL。以峰面积(x)为横坐标，以质量浓度(y，ug/mL)为纵坐标，绘制3者标准曲线，信噪比(S/N)为3时检出限(LOD)。回归方程、线性范围、检出限(LOD)见表2。标准曲线的相关系数R2达到0.997及以上，表明线性良好。

表2 草珊瑚中三种活性成分的标准曲线、线性范围及检测限

2.3.2 准确度和精密度

分别在草珊瑚样品中加入绿原酸0.2、0.4、0.8 mg；异嗪皮啶、迷迭香酸分别为0.5、1.0、2.0 mg，按照1.5的方法进行处理，每个浓度水平做5个平行，测定其回收率。方法的稳定性通过日内与日间实验来进行，由表3可得，日内绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的回收率达到92.7%～103.3%，相对标准偏差在2.1%～4.8%之间；日间绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的回收率达到92.2%～105.4%，相对标准偏差在1.5%～4.3%之间。回收率与相对标准偏差均在70%～120%和0～10%这两个允许的范围内，方法的稳定性与可靠性较好。

表3 日内日间回收率稳定性(n=5)测定结果表

2.3.4 样品分析

草珊瑚样品主要来源于丛江与榕江两个地方。称取草珊瑚样品1.0 g(精确至0.0001 g)，每个样品3个平行，按照1.5节的方法提取，稀释10倍，按照1.3节的方法进行检测。记录峰面积，根据2.3.1节中的标准曲线进行回归，算出对应样品中的含量，结果见表4。

表4 不同产地草珊瑚3个有效成分含量结果测定(n=3)

3 结论

本实验采用振荡提取、超声提取，加热回流提取法提取草珊瑚。并对超声(40 KHZ)提取法进行了优化，在温度为50 ℃下，提取10 min，绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的回收率为98.1%、95.3%、99.2%，与加热回流的效果相当，体现出高效、简单、易操作等优点。

建立了高效液相色谱测定草珊瑚药材中绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸含量的方法：样品在最优条件下提取后，以Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，4 μm)进行分离，流动相为乙腈/0.1%磷酸水(A/B)溶液采用梯度洗脱方式(0～9 min，20%A+80%B；10～15 min，40%A+60%B)，流速为0.6 mL/min，柱温为40 ℃，采用吸收波长344 nm。绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸浓度分别在0.50～20.0、0.5～20、5.0～100.0 ug/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸检测限分别为：0.025、0.010、0.10 mg/kg，日内与日间回收率(n=6)在91.8%～108.3%范围内，相对标准偏差在1.5%～4.8%之间。

利用本研究建立的绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸活性成分测定方法，对丛江与榕江两地，苗圃基地与林下种植的草珊瑚样品进行测定，结果表明绿原酸的含量在0.142～0.878 mg/g之间，异嗪皮啶的含量在0.252～1.055 mg/g之间，迷迭香酸的含量在0.378～1.707 mg/g之间。不同产地和种植方式决定了3者活性成分含量不同，一定程度上反映草珊瑚的质量，可以作为草珊瑚品质控制的指标。