赤霉素及其抑制剂调控草地早熟禾生长及赤霉素相关基因表达的研究

赵利清，郝志刚，崔笑岩，彭向永*

（1. 国家开放大学，北京 100039；2. 银河生态科技有限公司，北京 102488；3. 曲阜师范大学生命科学学院，山东 曲阜 273165）

草坪具有保持水土、降温增湿、美化环境等多种功能，对维护城市生态系统的稳定性具有非常重要的作用。但草坪草的生长速度快、分蘖能力强，在生长季节需要多次修剪才能够保持草坪的平整和优美，给园林养护增加了巨大的人力、物力和财力成本［1］。赤霉素（gibberellin，GA）是一类含四环双萜结构的植物激素，能够促进植物细胞的伸长生长［2］，植株的高度也被认为与赤霉素密切相关［3］。而一些赤霉素的合成抑制剂如矮壮素、多效唑、烯效唑等则可抑制植物生长高度。为了减少草坪修剪次数，降低管理成本，生产上使用矮壮素、多效唑等植物生长调节剂抑制草坪草的生长高度［4］。同时还发现，这些抑制剂能提高草坪草抗逆性，延长草坪使用年限，改善草坪质量和景观效果［5］。目前，关于生长调节剂调控草坪草生长高度的报道较多，但大多从生长和生理角度进行研究，而在解剖及分子水平上的研究较少［6-7］。本研究以温带地区应用广泛的草坪草—草地早熟禾（Poa pratensis）为材料，研究不同浓度的赤霉素及其两种抑制剂对草坪草生长、叶绿素含量及相关基因表达的影响，为草坪养护管理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

市售草地早熟禾种子，2019 年7 月在培养室中直播沙培育苗，室温控制在20～25 ℃，自然光照。6 周后选生长一致的2 叶龄幼苗，洗净根部泥沙，用1/2Hoagland 营养液继续培养，每盆营养液体积为9 L，每周更换1 次培养液，培养期间利用充气泵连续充气。在营养液中培养6 周后，待植株长到4～5 片成熟叶时开始试验。

1.2 试验设计

分别喷施赤霉素（GA3上海同瑞生物科技有限公司）、烯效唑（5%可湿性粉剂，江苏剑牌农化股份有限公司）和多效唑（15%可湿性粉剂，江苏剑牌农化股份有限公司）3 种植物生长调节剂1 次。根据前期试验结果并参考相关文献［1，8］确定浓度：50 和100 mg·L-1的赤霉素处理分别记作GA50和GA100，500（2000 mg·L-1）和1000 倍（1000 mg·L-1）烯效唑处理分别记作X500和X1000，500（2000 mg·L-1）和1000 倍（1000 mg·L-1）多效唑处理记 作D500和D1000，以喷施蒸馏水为对照CK。每处理3 个重复。继续培养10 周，测定各项指标。

1.3 试验方法

1.3.1 生长指标及生物量测定 叶长、叶宽及根长等生长指标用刻度尺直接测量。分别收获叶片和根，用自来水冲洗表面，再用去离子水洗净，吸干植株表面水分后称鲜重；105 ℃下杀青0.5 h，75 ℃下烘干至恒重。计算干物质含量（鲜重/干重×100%）和根冠比（根干重/枝叶干重）［9］。

1.3.2 叶绿素含量的测定［10］取草地早熟禾成熟叶片剪成细丝，采用80%丙酮避光提取法，721 分光光度计测定吸光值，分别计算叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素含量。

1.3.3 叶绿体分布观察［11］取成熟叶片的中部，制作徒手切片，奥林巴斯显微镜下观察并拍照。

1.3.4 赤霉素代谢相关基因表达 叶片总RNA 提取用RNAEasyspin Plant RNA Kit（Aidlab），使用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）合成cDNA 第1 链，具体步骤参照说明书。根据水稻（Oryza sativa）、短柄草（Brachypodium distachyon）、玉米（Zea mays）的同源基因的保守序列，利用在线工具OligoArchitect™（http://www.sigmaaldrich.com）设计赤霉素代谢相关基因引物，以草地早熟禾β-tublin 作为内参基因［12］，所有PCR 引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成（见表1）。LightCycler 480Ⅱ（Roche）荧光定量PCR仪进行qRT-PCR 反应。反应体系10 μL，包含cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）5 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，ddH2O 2.6 μL。反应程序为：95 °C 30 s；95 °C 5 s，60 °C 30 s，40 个循环；60 °C 读取荧光值；循环结束后95 °C 5 s，50 °C 30 s，最后进行溶解曲线分析。每个样品设3 个复孔。

表1 草地早熟禾赤霉素代谢关键酶基因qRT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of the key enzyme gene qRT-PCR for gibberellin metabolism in P.pratensis

1.4 数据处理

采用SPSS 19.5 和Excel 2010 进行数据统计分析，Duncan 多重比较检验（Duncans multiple range test）不同处理间的差异；单因素方差分析（one-way ANOVA）比较相同处理的平均值，数据为平均值±标准偏差。

2 结果与分析

2.1 生长调节剂对草地早熟禾生长指标的影响

由表2 可知，与对照组比较，G100处理的植株叶长和根长分别显著增加了35%和21%（P＜0.05），但叶宽无显著差异；抑制剂X500、X1000、D500和D1000处理的草地早熟禾叶长、叶宽及根长均下降，其中叶长达到了极显著差异水平（P＜0.01），叶宽及根长达到显著差异水平（P＜0.05），但不同抑制剂及浓度处理之间无显著差异。结果表明，植物生长调节剂均能调控草地早熟禾的叶长、叶宽及根长等生长指标。

表2 生长调节剂对草地早熟禾生长指标的影响Table 2 Effects of growth regulators on growth indices of P.pratensis

2.2 生长调节剂对草地早熟禾鲜/干物质积累的影响

表3 显示，与对照比较，G50和G100处理的草地早熟禾根鲜重分别升高了22%和23%，叶鲜重分别升高了28%和58%，叶干重和根干重上升，均达到了显著差异水平（P＜0.05），但叶和根的干物质含量无显著差异。抑制剂X500、X1000、D500和D1000处理的叶鲜重分别下降了30%、42%、32%和41%，达到了显著差异水平（P＜0.05），根鲜重分别显著下降了28%、34%、26%和26%，叶干重和根干重也均下降，达到了显著差异水平（P＜0.05），但根的干物质含量显著高于对照（P＜0.05）。计算草地早熟禾的根冠比发现，G50和G100处理的根冠比均下降，X500、X1000、D500和D1000处理的根冠比则分别比对照升高了47%、67%、53%和60%，均达到显著差异水平（P＜0.05）。结果说明植物生长调节剂均能够影响草地早熟禾叶片及根的干物质积累量。

表3 生长调节剂对草地早熟禾鲜/干物质积累的影响Table 3 Effects of growth regulators on fresh/dry matter accumulation of P.pratensis

2.3 生长调节剂对草地早熟禾色素含量的影响

表4 显示，G50和G100处理的叶绿素a 和叶绿素b含量比对照略有升高，但无显著差异，抑制剂X500、X1000、D500和D1000处理的叶绿素a 比对照分别显著升高了38%、35%、28%和33%，叶绿素b 分别显著升高了13%、13%、16%和21%（P＜0.05）。G50处理的类胡萝卜素含量与对照无显著差异，但G100处理却显著升高了21%，4 种抑制剂处理的草地早熟禾叶片中类胡萝卜素含量均显著高于对照（P＜0.05），但不同抑制剂及浓度处理之间无显著差异。结果说明植物生长调节剂均能够影响草地早熟禾叶片中的色素含量。

表4 生长调节剂对草地早熟禾色素含量的影响Table 4 Effects of growth regulators on pigments content of P.pratensis

2.4 生长调节剂对草地早熟禾叶片中叶绿体分布的影响

对照、G50和G100处理的叶片中叶绿体呈不均匀分布，多数分布在靠近上下表皮的叶肉细胞中，且上表皮附近分布的叶绿体略微多于下表皮，而叶片中部的叶肉细胞中几乎无叶绿体分布（图1a～c）。抑制剂X500、X1000、D500和D1000处理的叶片中，叶肉细胞变小，层数增加，叶绿体分布均匀，充满了叶片上下表皮之间的叶肉细胞中，叶片中部无明显的叶绿体分布空心区域，且叶绿体分布的密度明显高于对照及赤霉素处理组（图1d～g）。说明不同的生长调节剂处理不仅影响了草地早熟禾叶片中的叶绿体分布，而且也会影响叶绿体含量。

图1 草地早熟禾叶片横切面的徒手切片Fig.1 Free-hand sections of the leaves of P. pratensis

2.5 生长调节剂对草地早熟禾赤霉素相关基因表达的影响

图2 显示，与对照比较，G50和G100处理下，赤霉素合成途径中两个关键酶基因PpKAO和PpKS1的表达量下调；与活性赤霉素合成相关的基因PpGA20ox和PpGA3ox表达量均下调；但与活性赤霉素分解相关的PpGA2ox基因表达量达到了对照的4.6 和4.2 倍；赤霉素信号转导途径中的GA 受体蛋白PpGID1基因则显著下调表达（P＜0.05）。抑制剂X500、X1000、D500和D1000处理的赤霉素合成途径中关键酶基因的表达量均显著低于对照，仅信号转导途径蛋白受体基因PpGID1显著上调表达（P＜0.05）。

图2 生长调节剂对草地早熟禾赤霉素相关基因表达的影响Fig.2 Effects of growth regulators on the expression of gibberellin-related genes in P. pratensis

3 讨论

赤霉素是一类含四环双萜结构的植物激素，其最重要的生理功能之一就是促进植物细胞的伸长生长［3］，而赤霉素合成抑制剂如多效唑、烯效唑等则可抑制其发挥功效，它们作为重要的植物生长调节剂，已被广泛应用于农业生产中调控植物的生长发育［13］。喷施外源赤霉素后，草地早熟禾叶片和根伸长生长，叶片和根的干/鲜重均升高，但根冠比下降（表2 和表3），这是因为赤霉素可促进植物细胞伸长生长，体积增加，干物质累积量升高的同时，细胞含水量也增加，使植株的鲜重和干重均上升；但叶片伸长生长的比例却远高于根系，导致根冠比下降。喷施烯效唑和多效唑对植株生长具有显著的抑制作用，且以干物质量计算的根冠比却显著增加（表2 和表3），因为烯效唑和多效唑是赤霉素合成抑制剂，且对叶片的抑制作用大于根系，植株细胞变小，含水量降低，干物质相对含量升高，导致根冠比升高。这与西伯利亚翦股颖（Agrostis stolonifera）、黑麦草（Lolium perenne）等草坪草上的研究一致［14-15］。

本研究对叶片横切面观察发现，对照及赤霉素处理组叶绿体多数分布在靠近上下表皮的叶肉细胞中，且上表皮附近分布的叶绿体略微多于下表皮，而叶片中部的叶肉细胞中几乎无叶绿体分布（图1a～c）；而赤霉素抑制剂处理的叶肉细胞变小，层数增加，叶绿体均匀分布在叶片上下表皮之间的叶肉细胞中，叶片中部无明显的叶绿体分布空心区域，叶绿体数目显著多于对照（图1d～g）；抑制剂处理的草地早熟禾叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素的含量均升高（表4）。烯效唑和多效唑能够显著提高草坪草的叶绿素含量［6-7］，在形态解剖与理化水平上是一致的。

赤霉素生物合成途径相关基因的表达对植物的生长发育极其重要［16］。本研究中发现赤霉素处理后，PpKAO、PpKS1、PpGA20ox、PpGA3ox等基因的表达量均下调，而PpGA2ox基因显著上调（图2），说明赤霉素含量对赤霉素合成酶基因的表达具有反馈调节作用，这与在马铃薯（Solanum tuberosum）［17］、甜樱桃（Prunus avium）［18］上的研究结果一致。X500、X1000、D500和D1000处理后，活性赤霉素合成途径相关基因表达量进一步下调（图2），表明它们可通过抑制赤霉素的合成或分解活性赤霉素而减少植株体内活性赤霉素含量，抑制植株的伸长生长。本研究发现，赤霉素处理后的PpGID1下调表达，而赤霉素抑制剂处理后则显著上调表达，说明赤霉素信号转导途径相关基因的表达对植物的生长发育的调控也具有重要意义［19-20］。

4 结论

与赤霉素的效应恰好相反，烯效唑、多效唑均可抑制草地早熟禾的生长，降低干物质积累，提高叶片中叶绿素含量和根冠比，影响叶绿体的分布和赤霉素合成及信号转导途径中的相关基因表达，但未表现明显的浓度效应。实际生产中，在草坪修剪后立即喷施1000 倍的烯效唑或多效唑，可抑制植株生长发育，提高叶绿素含量和根冠比，对减少用工成本，增加草坪观赏性、提高园林绿化中的草坪草管护水平具有重要意义。