邻苯二酚对香椿叶青贮营养品质及抗氧化性的影响

陈德奎，吴硕，邹璇，周玮，陈晓阳，张庆

（广东木本饲料工程技术研究中心，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642）

氧化应激是机体遭受外界刺激导致代谢失衡，自由基产生效率提高而引起的自由基动态失衡，是造成机体细胞和组织损伤的一种不良反应［1］。早期的研究表明，在动物的日常饲粮中添加外源的抗氧化剂能够有效降低氧化应激给动物带来的伤害［2-4］。同时，在动物生产中，抗生素残留和细菌耐药性增强问题日益突出，天然植物添加剂的探索成为研究热点［5］。此外，天然植物添加剂的替代喂养方案能够提高动物的生长性能，对动物的生长具有积极作用，能够改善动物肠道的抗氧化性能，提高动物免疫能力，减轻动物对外部的应激［4，6］。

香椿（Toona sinensis）自古以来便具有药用和食用价值［7］。香椿叶中具有丰富的蛋白质（16.25%～17.78%）、维生素并富含萜类、皂苷和生物碱，具有抗菌、消炎和消除自由基抗氧化的功能［8］。用成熟的香椿叶饲喂肉羊，其营养价值与优质苜蓿（Medicago sativa）相近，并能改善动物肠道健康状况，减少腹泻的发生［9］。此外，黄酮类物质是香椿叶重要的成分之一［10］。在动物生产中，黄酮类物质能够有效降低动物的氧化应激，调节动物肠道黏膜形态和细菌微生态环境，控制胃酸的产生量以治愈胃溃疡并降低血液中胆固醇和血糖含量，促进血液循环［10-11］。然而，由于香椿的收获是季节性的，保存成为香椿叶跨季度饲喂的一个难题。青贮是木本饲料保存的一种常用方式，对香椿叶进行青贮能克服香椿叶全年供应不均的缺点。

邻苯二酚（catechol，1，2-dihydroxybenzene，C）又称儿茶酚，是青贮过程中植物酚经微生物代谢的次级产物，具有抑菌性和抗氧化性［12-13］。在青贮中添加邻苯二酚有助于抑制青贮过程中的不良微生物的生长并提高青贮的抗氧化性。此外，香椿叶的研究主要集中在其主要活性成分黄酮类物质方面，关于香椿叶青贮研究报道较少［14］。因此，本试验旨在研究邻苯二酚对香椿叶青贮发酵品质、蛋白质组分和抗氧化性的影响。

1 材料与方法

1.1 原料和试剂

红香椿叶（redT. sinensisleaf，RTSL）和绿香椿叶（greenT. sinensisleaf，GTSL）的鲜样（fresh matter，FM）于2020 年9 月采自华南农业大学启林北香椿种源试验林，为一年生处于同一生长时期的广东清远种源香椿。邻苯二酚（分析纯）购自上海麦克林生化有限公司。

1.2 试验设计

将新鲜的RTSL 和GTSL 在洁净的工作台上用铡刀切割成1～2 cm 片段，并充分搅拌混合均匀。分别在RTSL 和GTSL 中取3 份600 g 原料，其中两份分别添加0.5%邻苯二酚（0.5%C）和1.0%邻苯二酚（1.0%C），以不添加邻苯二酚为对照组（CK），并搅拌均匀。然后，将处理后的原料均匀分装到聚乙烯密封袋（20 cm×30 cm）中，每袋大概100 g，共6 个处理，每个处理6 个重复，共36 袋。随后，用真空密封机将密封袋中的空气抽出并密封放置在室内保存（27～30 ℃）。在青贮第15 天和第30 天开袋取样分析青贮发酵品质、化学成分和抗氧化性。

1.3 青贮品质和微生物数量分析

1.3.1 发酵品质测定（pH、有机酸、氨态氮） 随机取10 g 青贮样，与90 mL 经121 ℃高压灭菌20 min 的无菌蒸馏水充分混合均匀，在-4 ℃浸润24 h。然后，用中速定性滤纸过滤，取滤液。用pH 计（PHS-3C，上海雷磁）测定滤液的pH 值。部分滤液在-20 ℃冰箱中保存，用于后续氨态氮（NH3-N）和有机酸的测定。按照王成等［15］的试验方法，用苯酚-次氯酸钠比色法测定NH3-N 含量，使用高效液相色谱仪（LCMS-8050，SHIMADZU，日本）测定有机酸（乳酸、乙酸、丁酸）含量。

1.3.2 微生物数量测定 另取10 g 青贮样，与90 mL 经121 ℃高压灭菌20 min 的无菌生理盐水充分混合均匀，并用4 层纱布过滤，采用平板计数法计算微生物群落数量。取1 mL 滤液，将滤液从10-1等梯度稀释至10-6倍数。在30 ℃的厌氧培养箱中，分别用MRS（man rogosa sharpe）琼脂培养基（蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂17 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2）（环凯生物科技有限公司，广州）和结晶紫中性红胆盐琼脂培养基（蛋白胨10 g，酵母粉3 g，氯化钠5 g，乳糖10 g，胆盐1.5 g，结晶紫0.002 g，中性红0.03 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4）（VRBA，环凯生物科技有限公司，广州）培养乳酸菌和大肠杆菌48 h。在28 ℃生化培养箱中，用孟加拉红（虎红）培养基（蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，琼脂15 g，孟加拉红0.03 g，氯霉素0.1 g，pH 7.2）（环凯生物科技有限公司，广州）培养酵母菌和霉菌48 h。菌落数转化为log10表示，单位为cfu·g-1FM。

1.3.3 营养成分分析 将剩余的青贮样品在烘箱中105 ℃烘4 h 第一次称重，后续每隔0.5 h 称重一次至恒重，测定干物质（dry matter，DM）含量。然后，将烘干后的青贮样品用粉碎机粉碎，并过1.18 mm 筛。筛选后的粉样用于后续水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）、蛋白质组分和纤维含量的测定。采用蒽-酮比色法测定WSC 浓度［16］。采用全自动凯氏定氮仪（Kjeltec 8400，FOSS，丹麦）分析粗蛋白（crude protein，CP）含量。按照Licitra 等［17］的方法测定真蛋白（true protein，TP）含量。非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）含量为CP 含量除去TP 含量后的剩余部分。中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量用A220 纤维分析仪（ANKOM 科技公司，美国）进行分析。

1.4 抗氧化性分析

将约0.2 g 粉样与10 mL 甲醇涡旋混合均匀，置于摇床避光浸提24 h。然后，将提取液在离心机中3000 r·min-1离心10 min。取上清液约7 mL，在-20 ℃中保存备用，用于抗氧化性分析。按照He 等［18］的方法，测定自由基1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）清除活性、自由基2，2＇-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸［2，2＇-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS］清除活性和铁离子还原力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）活性，单位为mg trolox·g-1DM。

1.5 总黄酮含量测定

取0.5 mL 稀释前后的提取液和rutin 标准液（100，200，300，400，500，600，700，800，1000 μg·mL-1，R=0.9981）与0.15 mL 5% NaNO3充分混合，6 min 后加入0.15 mL 的10% AlCl3，再过6 min 加入4%NaOH，并加入2.2 mL 纯水。5 min 后测定510 nm 处的吸光值。总黄酮含量用rutin 当量表示（mg rutin·g-1DM）。重复3 次。

1.6 统计分析

采用SPSS 19.0 中的三因素方差分析（Three-way ANOVA）对香椿的发酵参数、营养组分和抗氧化性进行分析，显著性差异采用Duncan 多重极差检验，当P＜0.05 时，表示显著，P＜0.01 时，表示极显著。并用Pearson 相关系数分析香椿叶青贮抗氧化性与总黄酮含量之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 香椿叶的营养特性、微生物群落和抗氧化性

对RTSL 和GTSL 两种表型香椿叶原料特性进行了分析。结果显示，RTSL 与GTSL 原料的粗蛋白含量分别为12.9% DM 和15.2% DM，其中DM 含量分别为376 和332 g·kg-1FM；WSC 含量分别为86.7 和56.3 g·kg-1DM；NDF 含量分别为244 和309 g·kg-1DM；ADF 含量分别为138 和211 g·kg-1DM。乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌和霉菌的群落数量均低于检测水平（2.00 log10cfu·g-1FM）。此外，RTSL 和GTSL 原料的DPPH 自由基清除活性分别为249 和138 mg trolox·g-1DM；ABTS 自由基清除活性为764 和672 mg trolox·g-1DM；FRAP 活性为202 和112 mg trolox·g-1DM；总黄酮含量为78.0 和41.7 mg rutin·g-1DM。

2.2 香椿叶的青贮品质和微生物种群数量

与CK 相比，添加邻苯二酚显著降低了（P＜0.05）香椿叶青贮pH 值，添加0.5%C 对pH 值降低作用更显著；添加邻苯二酚显著降低了乳酸含量（表1），未检测到乙酸和丁酸。香椿叶青贮中均未检测到乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌和霉菌。

表1 红香椿叶和绿香椿叶的青贮品质及微生物群落分析Table 1 The analysis of fermentation quality and microbial communities of RTSL and GTSL silages

2.3 香椿叶青贮的蛋白质组分

与CK 相比，在RTSL 青贮第15 天，1.0%C 处理组中粗蛋白的含量显著降低，从12.1%降低至10.5%；非蛋白氮和NH3-N 含量均处于较低水平，无显著差异（表2）。青贮良好地保存了香椿叶蛋白质品质。

表2 红香椿叶和绿香椿叶青贮的蛋白质组分分析Table 2 The analysis of protein composition of RTSL and GTSL silages（% DM）

2.4 香椿叶青贮的抗氧化性和总黄酮含量

与CK 相比，添加邻苯二酚显著提高了香椿叶青贮自由基DPPH 清除活性、FRAP 活性和总黄酮的含量（P＜0.05），用1.0%C 处理效果更显著（表3）。随着青贮时间的延长，香椿叶青贮的总黄酮含量和自由基DPPH 的清除能力显著降低（P＜0.05），FRAP 活性也显著降低（P＜0.05），但仍保持在较高水平。为了进一步了解总黄酮和抗氧化性之间的关系，对总黄酮和抗氧化性进行Pearson 相关系数分析（表4）。Pearson 相关系数分析结果表明自由基DPPH 清除活性、自由基ABTS 清除活性和铁离子还原力（FRAP）活性均与总黄酮含量呈极显著正相关关系（P＜0.01）。

表3 红香椿叶和绿香椿叶青贮的抗氧化性分析Table 3 The analysis of antioxidants activity of RTSL and GTSL silages（mg·g-1 DM）

表4 香椿叶青贮总黄酮与抗氧化性的Pearson 相关分析Table 4 Pearson correlations between antioxidant activities（DPPH，ABTS，and FRAP）and total flavonoids for RTSL and GTSL silages

3 讨论

早前的研究表明，采摘时期、表型性状及种源均会对香椿的营养成分以及生物活性造成一定的差异［9］。耿涌杭等［19］发现采摘时期对香椿的饲用品质有较大的影响，不同的采摘时期香椿蛋白质含量为13.2% DM 至22.7% DM 不等，蛋白质含量随香椿生长时期延长而降低。 RTSL 原料CP 含量为12.9%DM，GTSL 原料CP 含量为15.2% DM，较早前的调查偏低，可能是由于本研究中RTSL 和GTSL原料生长年限相对较长。香椿叶富含黄酮类成分，具有清除自由基、抗癌、抗菌和调节机体免疫的药用性能；还具有降血压、降血脂和扩张动脉等功能［20］。本研究中，RTSL 和GTSL 原料中总黄酮含量分别为78.0 和41.7 mg rutin·g-1DM，含量较高。香椿叶的提取物能够降低血浆中的三酰甘油水平，从而减少动物肝脏脂肪细胞［21］。本研究中，香椿叶青贮自由基DPPH 清除活性均高于130 mg trolox·g-1DM；自由基ABTS 清除活性均高于670 mg trolox·g-1DM；FRAP 活性均高于110 mg trolox·g-1DM，具有较高的抗氧化性。在饲料中添加抗氧化剂，能够有效降低脂肪的氧化酸败，并且能够提高饲料转化率，促进动物生长发育［22-23］。因此，香椿具有较高的营养价值，并具有降低动物生产中的氧化应激的潜力。

在青贮过程中，香椿叶的pH 值（2.12～5.00）在较小的范围内波动，这可能与乳酸菌低于2.00 log10cfu·g-1FM 有关。此外，在所有香椿叶青贮中均未检测到大肠杆菌、霉菌和酵母菌等不良微生物，这可能与香椿叶自身的抑菌活性有关。香椿叶提取物对大肠杆菌、金色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有一定的抑菌活性［24］。因此，香椿叶在青贮过程中，蛋白质得到了良好的保存。香椿叶青贮30 d 后蛋白质水解指标NPN 和NH3-N 含量略微增加，但处于较低水平，TP 得到了良好的保存。随着青贮时间的延长，NPN 和NH3-N 的含量增加［25］。青贮后的微生物数量统计以及蛋白质组分变化表明，在香椿叶的青贮过程中，几乎无不良微生物发酵。青贮是保存香椿叶的一种可行方式。

香椿叶的生物活性与黄酮类化合物、类脂素、植物醇和香豆素等多种植物化学成分密切相关［26］。黄酮类化合物是植物酚类的一个重要亚群，多羟基结构使其具有较高的抗氧化性［27］。青贮30 d 后，RTSL 和GTSL 中总黄酮含量分别从78.0 和41.7 mg rutin·g-1DM 降低到了57.0 和22.3 mg rutin·g-1DM，这可能与酚类易分解的特点有关，而香椿叶之间总黄酮含量的差异可能与香椿叶的品种有关。经Pearson 相关分析表明，香椿叶青贮的抗氧化性（DPPH，ABTS，FRAP）与总黄酮含量呈极显著的正相关关系。青贮30 d 后，虽然香椿叶青贮总黄酮含量随着青贮时间的延长而下降了，但依旧表现出较强的抗氧化性。含邻苯二酚的抗氧化剂能通过非酶作用清除自由基来防止脂质过氧化，从而降低机体的氧化应激，减少疾病的发生［28］。与预期一致，添加邻苯二酚显著提高了香椿叶青贮的总黄酮含量，从而提高自由基DPPH 的清除活性和FRAP 的还原力活性，但自由基ABTS 的清除活性无明显变化，邻苯二酚提高青贮抗氧化性效果显著。香椿叶中添加邻苯二酚进行青贮后作为饲料添加剂，不仅具有调节饲料营养品质的潜力，而且具有提高动物机体抗氧化性的潜力。

4 结论

本研究结果表明，香椿叶具有较高的营养价值。青贮过程中，香椿叶的蛋白质含量无显著变化，NPN 和NH3-N 的含量维持在低水平，青贮的方式有效保存了香椿叶的营养品质。添加邻苯二酚对香椿叶进行青贮，青贮的总黄酮含量得到了显著提高，自由基DPPH 清除活性和FRAP 活性也得到了显著提高。邻苯二酚有效提高了香椿叶青贮的抗氧化性。