病证结合便秘动物模型研究进展

2022-03-25朱书斌刘金响张聪伟冯群虎

世界中医药 2022年13期

朱书斌刘金响张聪伟冯群虎

(1 陕西中医药大学，咸阳，712046； 2 陕西中医药大学第一附属医院，咸阳，712000； 3 深圳市保安中医医院，深圳，518100)

便秘是指排便困难，每周大便次数少于3次，伴或者不伴大便干硬的疾病[1]，具有顽固性、复发性的特点，可发生于任何年龄段。现代医学中尚无特效药物能彻底治愈便秘，仅能对症治疗取得短期疗效，常用的药物有乳果糖、聚乙二醇电解质散、开塞露等，但导泻药多具有依赖性，停药后易反复，长期使用会导致严重的并发症，威胁患者的身体健康[2]。而中医药通过辨证论治，可以取得较好的疗效，同时减少患者的不良反应及复发率[3]。有研究发现，近10年中医治疗便秘机制的研究中，中医证候便秘造模多选用西医学实验的便秘动物模型[4-5]。中医辨证论治体现在不同的中药方剂治疗不同的证型[1]，因此在基础实验中，设计特定证型的动物模型至关重要。但中医证型抽象，相关的研究经验比较缺乏，目前的研究均采用“病证结合”的方式复制相关证型的模型[4]，在便秘的动物模型中，此种方法亦被广泛使用。虽然有相关的综述阐述了便秘不同证型动物模型复制方法[5-6]，但仍比较笼统，对用药剂量、造模时间、造模流程等叙述不清，对模型复制的指导意义不大。为了深入了解中医证型便秘模型复制过程中的细节问题，现从药物剂量、造模周期、模型评价方式等细节方面进行归纳综述，为以后的研究提供参考。

1 便秘动物模型分类

根据《便秘中医诊疗专家共识意见(2017)》，临床分为“热积秘”“寒积秘”“气滞秘”“气虚秘”“阳虚秘”“阴虚秘”6种证型[1]。通过文献整理发现中医证型便秘模型与临床分型不完全相同，常见的动物模型包含“脾虚型便秘”“血虚型便秘”“阳虚型便秘”“津亏型便秘”4种，以虚证便秘居多。

2 便秘模型复制方法

2.1 脾虚型便秘脾虚型便秘多选用昆明小鼠，模型复制方法为“番泻叶灌胃+控制饮食、饥饱失常法”[7-9]。先用浓度为100%的纯番泻叶溶液灌胃，制造脾虚证模型；待脾虚模型制备成功后，再用控制饮食，给予模型动物间断性喂食的方法制备便秘模型。脾虚型便秘模型具体复制方法如下：第1步，先将所有小鼠适应性喂养2～7 d，然后利用100%浓度的纯番泻叶溶液0.4～0.8 mL给小鼠灌胃，每日灌胃2次，连续灌胃7 d，番泻叶灌胃期间，所有小鼠自由饮食；第2步，从第8天开始，停止番泻叶灌胃，并禁饮食，每隔1 d给每只小鼠4～8 g低纤维饲料生大米，并让所有小鼠自由饮水0.5 h，之后继续禁饮食，共持续8 d。脾虚便秘的造模共持续15 d，造模结束后评价小鼠造模是否成功。

若小鼠体型干瘪、瘦小、体毛无光泽、拱背、精神萎靡，活动减少，体质量减轻，大便干燥结块、排便减少、大便颗粒细小；肠道组织特征：将模型动物颈脱臼处死后解剖，若大便集结在结肠，且大便性状为球状或串珠状，空肠、回肠无明显粪便残留；肠道推进率和血清D-木糖水平降低，则表示脾虚便秘模型复制成功。肠道推进率评估方法：在造模结束后，给予活性炭或者墨汁灌胃，观察模型动物与正常动物第1粒黑便排出时间，若大于正常动物的排出时间，则表示肠道推进率降低。

100%浓度的纯番泻叶溶液制备方法参照彭昕欣等[10]的研究：第1步，取500 g番泻叶，并加入10倍量的沸水，即5 000 g沸水，浸泡10 min；第2步，将番泻叶过滤，取得的滤液放入75 ℃的水浴锅中蒸发浓缩，当生药浓度达到1 g/mL时，100%浓度的纯番泻叶溶液制备成功。制备成功的纯番泻叶溶液需要放置在4 ℃的条件下保存备用。

2.2 血虚型便秘血虚便秘模型多选用昆明小鼠(KM小鼠)，采用“腹腔注射药物+灌胃”的方法制备，模型复制周期共28 d[11-12]。具体复制步骤如下：第1步，先将小鼠适应性喂养2～7 d，在自由饮食的情况下，在第1、4、7、10天的时候，按照小鼠体质量60 μg/g的剂量给予乙酰苯肼皮下注射，1次/d；第2步，在第10～14天时，按照小鼠体质量40 μg/g的剂量给予环磷酰胺腹腔注射，1次/d，用以复制血虚模型；同时在第10～14天时，按照小鼠体质量25 μg/g的剂量给予复方地芬诺酯混悬液灌胃，1次/d，复制便秘模型；第3步，将第1步和第2步的操作重复1次，复制血虚便秘小鼠模型。此外，在刘五州等[13]的研究中，报告了另一种血虚便秘造模方法：模型复制共需要4周，所有动物正常喂养。第1步，在老鼠适应性喂养结束后，将鼠尾尖部消毒后，剪去尾尖端2 mm，并将尾尖浸入38 ℃恒温水浴中放血3 min，之后再正常喂养2周；第2步，从第3周开始，每次用20 μL毛细吸管，在眼眶静脉窦放血约0.6 mL，每周1次，制备血虚模型；同时从第3周开始，采用盐酸洛哌丁胺灌胃，按照小鼠体质量3.0 mg/kg的剂量换算，1次/d，持续2周，以复制便秘模型。若模型动物出现精神萎靡、蜷缩、运动量减少，毛枯疏、无光泽，耳、鼻、唇、尾苍白，排便次数减少，粪便质地干结、粘连，肠道推进率降低，同时血液中红细胞及血红蛋白水平下降，则表示血虚便秘模型复制成功。

2.3 阳虚型便秘阳虚型便秘模型复制方法有2种。第1种以“食醋+冰水活性炭灌胃”复制阳虚秘模型[14]：现有的阳虚秘模型研究以大鼠为主，造模周期共9 d，适应性喂养2～7 d。造模的第1天按照大鼠体质量20 mL/kg的剂量，给予白醋灌胃，之后以15 mL/kg的剂量灌胃，1次/d；并在第7天开始，加用0 ℃的活性炭冰水灌胃，2次/d，持续3 d，模型复制完成。第2种以“咯哌丁胺悬液灌胃+给予氢化可的松肌内注射”的方法进行模型复制[15]：造模周期共21 d，选用200 g左右的Wistar大鼠，造模周期共21 d。先按照大鼠体质量3.0 mg/kg给予咯哌丁胺悬液灌胃，同时按照25 mg/kg的剂量给予氢化可的松后肢肌内注射，1次/d。造模完成后，给予大鼠活性炭灌胃1次，记录大鼠排出首粒黑便的时间。若模型动物出现畏寒喜暖、踡缩、运动量减少，倦怠嗜睡、消瘦，大便质地干或不干，排出困难，且肠道推进率降低，表明阳虚便秘模型复制成功。

2.4 津亏型便秘津亏型便秘目前尚无成熟的动物模型，现有的研究多采用“限水+药物注射或灌胃”的方法复制便秘模型，共有2种。第1种采用“限水+洛哌丁胺灌胃法”进行模型复制[16]，多采用无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级SD[美国斯泼累格·多雷(Sprague Dawley)农场用Wistar大鼠培育而成]大鼠，造模周期共5周。但现有文献中对给药的次数、持续时间、具体饮水剂量均未明确描述，具体操作中仍需审慎参考。每只大鼠每日正常进食，给予每日平均正常饮水量的1/3，为严格控制单只大鼠饮水量，具体饮水量需要根据前期实验获得更严谨的数据，并按照大鼠体质量1.5 mg/kg的剂量给予洛哌丁胺溶液灌胃，按照125 mg/kg的剂量给予D-半乳糖皮下注射。第2种采用“限水+复方地芬诺酯混悬液灌胃”[17]，选取200 g左右的SD大鼠，造模周期为7 d，每只大鼠每日正常进食，给予每日平均正常饮水量的1/3，约10 mL；同时按照大鼠体质量10 mg/kg的剂量，将复方地芬诺酯溶入2 mL的生理盐水中，制成混悬液，另行灌胃。每只大鼠每日灌胃4次，第1次先用复方地芬诺酯混悬液灌胃，之后将10 mL双纯水分3次进行灌胃，每次间隔时间相等。若实验动物出现粪便干硬，呈黄豆样大小，精神倦怠、皮毛光泽变暗、小便量少色黄，排便次数、排便量显著减少，同时，肠道推进率降低，解剖见粪粒积结在结肠，呈圆珠状或串珠状，空肠、回肠内容物较少，则津亏便秘模型复制成功。

3 讨论

3.1 便秘动物模型的中医理论基础中医理论认为虚证便秘的病因与患者的体质、饮食习惯、年龄等有关[1]。若患者饮食劳倦，损伤脾胃或过食生冷、苦寒攻伐，伤及气阳，中焦脾胃受损，则水谷运化无力，气虚则大肠传导无力，阳虚则肠道失于温煦，致使阴寒内结，排便时间延长，导致便秘；年老患者，素体阴虚，或失血夺汗，伤津亡血，导致阴亏血少，血虚则大肠不荣，阴亏则大肠干涩，肠道失润，大便干结，便下困难，而成便秘。

在脾虚便秘中，利用“番泻叶灌胃+控制饮食、饥饱失常法”复制动物模型[9,18]，番泻叶苦寒攻下，药效峻猛，损伤气阳；控制饮食、饥饱失常则损伤脾胃，模型具备一定的合理性，但番泻叶属于攻下药，常用于脾虚泄泻动物模型的复制[19-20]，用于便秘模型仍有一定争议；在阳虚便秘模型中，运用“0 ℃冰水灌胃”复制阳虚模型，遵循中医“苦寒伤阳”的理论，但冰水灌胃首先伤及脾胃，所复制模型应为脾阳虚模型；“注射氢化可的松”复制的阳虚模型应为肾阳虚模型[21]，基于现代医学理论的研究认为肾阳虚的病理机制与下丘脑-垂体-靶腺轴功能紊乱有关，而氢化可的松可导致使下丘脑-垂体-肾上腺功能减退，抑制促肾上腺皮质激素的释放，模拟中医理论的肾阳虚证[22]。在血虚证模型中[11]，乙酰苯肼是一种强氧化剂，可以诱导溶血，导致红细胞和血红蛋白减少；环磷酰胺是一种细胞毒性化疗药物，会产生骨髓抑制作用，导致骨髓造血系统异常，2种药物联合，导致实验动物发生贫血，模拟中医理论的血虚证，但有会议论文报道环磷酰胺还用于肾阳虚模型的制备[23-25]，理论基础仍不十分明确；“剪尾法”使得实验动物失血，模拟“亡血”病因导致的血虚证。在津亏模型的复制中，限制实验动物饮水可以模拟伤津的病因，但限水方法描述不够完善，缺少每日饮水量，需要前期实验获得数据，为控制实验变量，保证造模成功率，每只实验动物应单笼饲养，但目前的文献未明确报告饲养方法。

3.2 中医证型动物模型的局限性中医理论中的“证”概念较抽象，不同于现代医学的疾病概念，一个完整的证型诊断必须包括舌苔和脉象，但是在动物模型中目前尚无法做到对舌苔、脉象的复制和观察，缺少了中医证型辨证的一个重要体征[26]。在目前的研究中，中医证型的动物实验多采用“病证结合”的方式，利用现代医学手段，分别复制西医疾病模型和中医证型模型，二者叠加构成中医证型的动物模型，这种模型复制方式，割裂了中医理论中病和证的关系，不合乎中医临床病证的理念[4]。在模型复制过程中，实验动物所用的药物种类较多，如番泻叶、环磷酰胺、乙酰苯肼、氢化可的松、地芬诺酯、洛哌丁胺，其中不少药物复制的动物模型仍存在一定争议，如环磷酰胺剂可以导致血虚[11,27-28]，也可以导致阳虚[23-25]；番泻叶常用于脾虚泄泻模型[19]，是否可以用于便秘模型；还有人认为冰水灌胃属于冷秘模型[29]。还有药物使用剂量的问题，在同一证型的模型中，存在不同的使用剂量，缺乏统一的标准。

除以上问题，便秘动物模型尚缺乏科学严谨的评价标准，现有的研究评估手段单一，针对便秘的评估以粪便质地、数量、第1粒黑便排出时间、肠道推进率等为主；针对中医证型的评估指标仅以实验动物的症状为主，但却存在症状相似的问题，如血虚、肾虚、脾虚模型均有实验动物消瘦、倦怠、蜷缩的症状，证型鉴别存在一定困难，模型复制成功的评价标准仍需进一步研究完善。

3.3 中医证型动物模型改进方法首先，改进病证结合法模拟的中医证型，在模型复制阶段，不应机械地将中医证型模型和便秘模型叠加，应根据实验设计及所要验证的中药治疗理论机制，结合中医病因病机，从饮食、情志、生活习性等方面复制中医证型模型，更符合临床实际情况。如针对阴虚模型，采用年老的大鼠[30]；热秘模型采用高脂高热量喂养，模拟饮食习惯所致的便秘；其次，完善模型评价体系，对中医证型及便秘模型分开评价，在便秘模型评价指标中，存在相似症状及体征，无法做到“四诊合参”，容易干扰判断。应参考现有的研究，结合现代医学的检测手段，适当纳入血液指标的检测，并充分观察实验动物的表现，扬长避短，如血虚模型检测红细胞及血红蛋白水平[13]，津亏模型检测肠道含水量等[31-32]。便秘模型的评价可以通过观察大便性状、含水量，并结合肠道推进率评估，将评估指标统一；在便秘造模用药中，根据不同的实验需求选取不同的药物，探索造模用药的最佳剂量，节约实验成本，将实验规范化、合理化。