潜态相关多肽蛋白在结直肠腺瘤癌变中的作用研究*

蔡文聘，房太勇

福建医科大学附属第二医院，福建 泉州 362000

结直肠癌（CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率位居全球恶性肿瘤的第三位，死亡率则位居第四位［1］。据2018年我国最新癌症报告显示，其发病率及死亡率在恶性肿瘤中均位居前五位且保持上升趋势［2］。CRC的发生途径大致分为腺瘤—腺癌途径（含锯齿状腺瘤引起的锯齿状途径）、炎症—异型增生—癌途径及de novo途径，其中以腺瘤—腺癌途径为主。潜态相关多肽（LAP）是一种与TGF-氨基末端非共价结合的前肽，两者结合后产生的TGF-β复合体的解离可激活TGF-β的生物活性从而发挥作用。报道指出，LAP+CD4+T细胞是一种新的抑制性细胞亚群，可通过IL-10和TGF-β介导其免疫抑制作用进而促使肿瘤发生免疫逃逸［3］，其中就包括CRC。然而关于LAP与结直肠腺瘤（CRA）的研究则相对较少，本研究旨在通过检测LAP蛋白在不同状态下的CRC及CRA中的表达情况，同时分析上述各者间的关系，从而进一步研究LAP蛋白在CRA癌变过程中所起的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年9月—2017年6月在福建医科大学附属第二医院诊治的研究对象的肠组织标本，所有标本均经常规H&E染色并由专业病理科医师做出病理诊断，其中结直肠腺癌患者排除术前接受化疗、放疗或免疫治疗，且三组研究对象均排除既往肿瘤疾病史、自身免疫性疾病（包括炎症性肠病）及感染性疾病史。研究对象的临床资料具体如下。（1）健康体检者组25例：男12例，女13例，平均年龄（44±10）岁。（2）结直肠腺瘤组25例：男16例，女9例，平均年龄（56±10）岁；其中直肠腺瘤5例，结肠腺瘤20例；伴有高级别上皮内瘤变11例，伴有低级别上皮内瘤变14例。（3）结直肠腺癌组33例：男19例，女14例，平均年龄（61±12）岁；其中直肠腺癌14例，结肠腺癌19例；有淋巴结转移19例，无淋巴结转移14例；浸润深度T1～T4分别为5例、5例、10例、13例（参照AJCC／UICC的结直肠癌TNM分期系统）。本研究所有受试者均知情同意，研究方案经医院医学伦理委员会审批后同意执行。

1.2 方法

每个组织标本离体后分成两部分，一部分放入10%福尔马林固定，行常规H&E染色并由专业病理科医师进行病理诊断，对应的另一部分迅速置入-196℃液氮速冻，后转送入-80℃冰箱保存备用。检测开始前将组织样品用干净的剪刀尽量剪碎，后经过含有PMSF的RIPA裂解液裂解、离心等步骤提取组织蛋白，并采用BCA试剂盒检测提取的蛋白浓度。测定后将剩余蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳（90 V 30 min，下层分离胶120 V 60 min）。采用PVDF膜进行转膜（100 V 60～90 min）。使用5%脱脂奶粉封闭后依次与一抗（鼠抗人Foxp3单克隆抗体1∶500稀释；鼠抗人LAP单克隆抗体1∶2 000稀释）、二抗（羊抗鼠单克隆IgG抗体1∶5 000稀释）反应，在避光条件进行曝光、采图，以GAPDH作为内参进行标准对照,最后分析LAP蛋白的表达情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），等级指标采用Spearman相关系数分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康体检、结直肠腺瘤及结直肠腺癌三者组织中LAP蛋白的表达情况

运用Western-Blot印迹法检测各组织中LAP蛋白的表达情况，见图1。运用单因素方差分析对三组间LAP蛋白的表达水平进行分析，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1 Western-Blot印迹法检测三者的LAP蛋白水平（部分结果）

表1 LAP蛋白在三组中的表达水平（±s）

表1 LAP蛋白在三组中的表达水平（±s）

a表示与健康体检者组及结直肠腺癌组比较，P＜0.001；b表示与健康体检者组比较，P＜0.05。

组别健康体检者组（n=25）结直肠腺瘤组（n=25）结直肠腺癌组（n=33）LAP 0.245±0.188 0.861±0.276a 1.157±0.575b

2.2 结直肠腺瘤组织中LAP蛋白的表达水平与上皮内瘤变级别的关系分析

运用Spearman相关系数分析LAP蛋白的表达水平与腺瘤上皮内瘤变级别之间的关系，可见LAP蛋白的表达水平与腺瘤上皮内瘤变的级别呈正相关（rs=0.849），差异有统计学意义（P＜0.001）见表2。

表2 结直肠腺瘤组LAP蛋白表达水平与上皮内瘤变级别关系（±s）

表2 结直肠腺瘤组LAP蛋白表达水平与上皮内瘤变级别关系（±s）

上皮内瘤变级别低级别（n=14）高级别（n=11）LAP 0.949±0.687 1.136±0.161

2.3 结直肠腺癌组织中LAP蛋白的表达水平与临床病理的关系分析

运用独立t检验分析LAP蛋白的表达水平与腺癌淋巴结转移的关系，可见LAP蛋白的表达水平与腺癌淋巴结转移相关，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。运用Spearman相关系数分析LAP蛋白的表达水平与腺癌浸润深度的关系，可见LAP蛋白的表达水平与腺癌浸润深度呈正相关（rs=0.543），差异有统计学意义（P=0.001），见表4。

表3 结直肠腺癌组LAP蛋白表达水平与淋巴结转移关系（±s）

表3 结直肠腺癌组LAP蛋白表达水平与淋巴结转移关系（±s）

a表示与无淋巴结转移比较，P＜0.05。

淋巴结转移有（n=19）无（n=14）LAP 1.458±0.681a 0.961±0.403

表4 结直肠腺癌组LAP蛋白表达水平与腺癌浸润深度关系（±s）

表4 结直肠腺癌组LAP蛋白表达水平与腺癌浸润深度关系（±s）

浸润深度T1（n=5）T2（n=5）T3（n=10）T4（n=13）LAP 0.712±0.314 0.758±0.156 1.218±0.475 1.434±0.662

3 讨论

CRC是常见的消化道恶性肿瘤，在疾病晚期可明显缩短患者生存期，同时可引起一系列并发症（如消化道出血、穿孔、梗阻等），进而增加患者痛苦、降低患者生活质量，给家庭乃至国家带来经济负担。要解决上述难题，重点及难点就在于如何实现对CRC的早诊早治。

在CRC的早期诊断方面，目前关于CRC早期诊断的指标多种多样，既往常见的粪便隐血试验和血清CEA及CA199等指标因特异度和灵敏度较低均限制了其价值。随着分子生物学及高通量检测技术的飞速发展，包括相关核酸标志物及蛋白标志物等在内的新型诊断指标不断涌现，其中，在相关核酸标志物方面，循环肿瘤DNA（ctDNA）［4］、环状RNA（circRNA）［5］、长链非编码RNA（lncRNA）HNF1A-AS1［6］及微小RNA1229（miR-1229）［7］等均已被证实可以作为CRC早期诊断的潜在标志物。而在相关蛋白标志物方面，自身抗体，包括抗P53蛋白自身抗体（Ap53Ab）［8］、CEA-IgM［9］、抗黏蛋白（MUC）自身抗体，抗凋亡抑制（IAP）蛋白自身抗体等，基质金属蛋白酶家族（MMP3）、血小板反应蛋白（THPS2）、胶原蛋白家族的COL10A1等［7］亦被证实可以作为CRC早期诊断的潜在标志物。然而上述生物标志物的作用更多的体现在CRC的发展及预后方面，且检测费用昂贵，不适用于临床普及推广。研究表明［10］，从腺瘤到腺癌这个演变过程通常需要10～15年的时间，然而并非所有CRA都会发生癌变，也并非所有CRA都要经过10年以上历程才会演变为腺癌，因此对于高危CRA的识别显得尤为重要。目前关于CRA发生癌变的始动因素及促进因素的研究仍寥寥无几。吴义娟等［11］研究表明，肿瘤转移相关基因（MTA1）、逆转诱导的富含半胱氨酸、含有kazal域的蛋白（RECK）在结肠腺瘤的癌变过程中起重要作用，而王少军等［12］研究表明，Decorin蛋白在高危CRA中的表达下降，可用于结肠腺瘤恶性程度的评价。本研究中CRA组织中的LAP蛋白水平高于健康体检者而低于CRC患者，同时与上皮内瘤变的级别呈正相关，这提示LAP蛋白很有可能参与了CRA癌变的发生及发展，可作为高危CRA的识别因素之一。

在CRC的早期治疗方面，目前消化内镜下治疗技术（如ESD）已日趋成熟，逐渐成为早期CRC的主流干预措施。国内多个指南及共识［13-14］均指出存在下列情况者：（1）基底切缘阳性。（2）组织学呈分化差的癌（低分化腺癌、未分化癌、印戒细胞癌、黏液腺癌等）。（3）黏膜下浸润深度≥1 000μm。（4）脉管侵犯阳性。（5）肿瘤出芽G2/G3，被视为早期CRC内镜下非治愈性切除，需进一步追加外科手术。然而近几年国内外出现越来越多关于早期CRC内镜下非治愈性切除术后追加外科手术结果阴性的病例报道。孙跃明等［15］研究结果提示，早期CRC内镜下非治愈性切除术后追加外科手术的患者中有90.2%呈现阴性结果。王瑞刚等［16］研究均支持黏膜下浸润深度≥2 000 μm是早期CRC内镜下非治愈性切除术后预后不良的危险因素。早期CRC内镜下非治愈性切除术后追加外科手术的指征里面将浸润深度限定在1 000μm以内，根本原因还在于对淋巴结转移的风险担忧。本研究结果提示，LAP蛋白的表达水平与腺癌淋巴结转移及浸润深度呈正相关，若将LAP蛋白的表达与上述标准综合考虑，可进一步减少早期CRC内镜下非治愈性切除术后追加不必要外科手术的可能。

在进展期CRC的诊治方面，目前主要是采取包括手术及化疗在内的综合治疗，但是创伤较大且部分效果欠佳，同时存在无法耐受手术及化疗的情况，这迫使我们需要寻求一种新的治疗手段。调节性T细胞（Tregs）是目前发现的一种具有免疫抑制功能的重要细胞亚群，被证实在多种恶性肿瘤（包括CRC）组织内浸润，可促使肿瘤发生免疫逃逸，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关，LAP+CD4+T细胞就是其中的一种Tregs。MAHALINGAM等［17］从CRC患者的外周血中分离出LAP+CD4+T细胞，发现外周血中的LAP+CD4+T细胞同样具有免疫无能性及免疫抑制性。钟武等［18］研究显示，LAP+CD4+T细胞的分布依次为CRC肿瘤组织、CRC外周血、相应癌旁组织及健康志愿者外周血，提示LAP+CD4+T细胞易聚集于CRC肿瘤组织中，可能参与了CRC的发生、发展及转移。本研究结果与文献一致，因此LAP相关免疫制品将为进展期CRC的治疗提供新选择。

综上所述，LAP蛋白对CRA癌变的发生及发展起到促进作用，同时有望成为制定早期CRC内镜下非治愈性切除术后进一步干预标准的参考指标之一。当然，本研究尚存在些不足，比如样本量较小，T1癌中未进一步细化SM1期癌、SM2期癌等与LAP蛋白的表达水平的相关性等，期待在日后的研究工作中可得到进一步的证实。