金银花中绿原酸的水提取工艺研究

丁敏，王丽玲，秦玉川，刘本同，黄旭波，童晓青，方茹，王衍彬

（1.丽水市森林资源保护管理总站，浙江 丽水，323000；2.浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023）

金银花是忍冬科Caprifoliaceae 植物忍冬Lonicera japonica的干燥花蕾或初开的花，一般夏初花开放前采收，干燥后使用[1]。金银花是常用的传统药食同源中药，具有清热解毒，疏散风热的功效，并表现出抗炎、抗菌、抗病毒和抗氧化等多种药理作用[2-3]。研究表明，金银花的主要有效成分为有机酸、黄酮类等多类活性成分[4-6]，其中，绿原酸（Chlorogenic acid）是含量最高的有机酸成分。

绿原酸，即3-咖啡酰奎宁酸，是由奎宁酸与咖啡酸形成的带有酯键的羟酚酸，是植物体内有氧呼吸经HMS途径产生的一种苯丙素类次生代谢产物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血压、降血脂、保肝利胆、增加白血球、清除自由基和兴奋中枢神经系统等药理活性[7-9]，因而成为生物活性物质研究领域的热点之一。目前，绿原酸是一种具有极高药用价值和经济价值的纯天然提取物，被广泛应用到人用药品、保健品、化妆品、饮料、饲料、兽用药等领域[10]。因而，综合利用金银花植物资源，实现精深加工和高值化利用，符合国家农业产业结构调整以及助力乡村振兴战略。

目前，关于金银花绿原酸不同提取工艺已有许多报道，包括以传统有机溶剂为提取介质，如乙醇提取[11-12]、甲醇提取[13]；以生物酶加水为溶剂提取，如纤维素酶解法提取[14]；以及以新型溶剂为介质提取，如离子液体提取[15-16]、低共熔溶剂提取[17]等，尽管这些工艺技术各具特点，但是它们对生产条件和设备均具有一定的要求，不适用于在传统金银花种植产地进行规模化生产。其次，虽然目前的文献中对于金银花中绿原酸提取的研究较多，如曹晓琴[18]等以水煎煮法、乙醇索氏提取法、醇提法、酸醇提取法、乙醇超声提取法进行不同溶剂和方法的提取比较研究；李杨等[19]以水为溶剂采取传统浸提法、渗漉提取法、索氏提取法、微波提取法、超声波提取法对金银花凉茶中的绿原酸进行提取，但对于回流法、超声法、煎煮法与药典方法的研究较少，且对金银花中绿原酸仅仅以水为溶质的提取研究更少。此外，水是各种化学和生物过程的理想溶剂，它对环境的影响最小，安全问题也少。在天然活性物质的提取过程中，绿色溶剂水一直都是首要考虑的提取剂。本研究选择水为溶剂，探索了不同水提取方法与主要因素对金银花绿原酸提取率的影响，以期对金银花中绿原酸的绿色、简便与高效提取制备提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金银花药材，购买于杭州某药店。烘干药材至含水量低于6%，磨成粉，过100 目筛置于干燥器中备用。绿原酸标准品购自中国食品药品检定研究院，色谱级乙腈购自霍尼韦尔贸易（上海）有限公司，甲酸、甲醇、磷酸等试剂为分析纯，均购自上海凌峰化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

日本岛津LC-20AD 高效液相色谱仪系统，包括岛津SIL-20A 自动进样器、岛津LC-20AD 泵、岛津SPD-20A紫外-可见光检测器、岛津CTO-20A 柱温箱；DLSB-5/10℃低温冷却循环泵，杭州惠创仪器设备有限公司；循环水式多用真空泵，杭州大卫科教仪器有限公司；旋转蒸发器RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂；KQ-300DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；G2X-9076MBE 电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；数显恒温水浴锅，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；电子天平，丹佛仪器有限公司；SCIENTZ-10N 冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；ZF-7 型暗箱三用紫外分析仪，上海嘉鹏科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 绿原酸的HPLC 测定与标准曲线的制作 采用Thermo C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 µm），以乙腈－0.1%甲酸（13∶87）溶液为流动相，流速为1 mL·min-1，检测波长为327 nm，柱温为30℃。以峰面积y及不同绿原酸标准品浓度x（µg·mL-1）绘制标准曲线，得到绿原酸回归方程为：y=27 927x－1 716.1（R2=1），线性范围为20～ 100 µg·mL-1。按照本液相方法测定得到样品中绿原酸的峰面积，由标准曲线方程计算得到绿原酸浓度。用回流法提取金银花样品，分别在0、2、4、8、12、24 h 时进样，按照上述色谱方法测定峰面积，结果显示峰面积相对标准偏差（Relative standard deviation,RSD）为1.26 %，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

1.3.2 不同提取方法比较实验 药典法提取：取金银花粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，称定质量，超声（40 KHz）处理30 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足损失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。应用1.3.1 方法得到绿原酸浓度，进一步计算得到该批次金银花中绿原酸含量为3.97%±0.05%，本研究中以下提取方法实验结果均以该绿原酸得率为100%计算相对提取率（R）。

式中，A1为实验所得绿原酸提取率；A0为药典法测得金银花绿原酸含量。

煎煮法提取：取金银花粉末10 g，精密称定，置不锈钢小锅中，加1 000 mL 蒸馏水煎煮2 次，每次1 h，合并提取液，过滤。将提取液减压浓缩后定容至100 mL，再取1 mL 提取液加50%甲醇定容至50 mL。经HPLC检测后计算绿原酸相对提取率。

回流法提取：取金银花粉末1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加20 mL 水回流提取2 次，每次1 h。合并提取液过滤并定容到100 mL，再取1 mL 提取液加50%甲醇定容至50 mL。经HPLC 检测后计算绿原酸相对提取率。

超声法提取：到金银花粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加20 mL 蒸馏水30℃超声（40 KHz）提取2 次，每次1 h。合并提取液过滤并定容至100 mL，再取1 mL 提取液加50%甲醇定容至50 mL。经HPLC 检测后计算绿原酸相对提取率。

1.3.3 水回流提取工艺单因素实验

1.3.3.1 不同提取温度 金银花粉末1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入30 mL 水，温度分别设定为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，各回流提取1 h。每处理提取2 次，合并提取液滤过定容至100 mL。精密量取1 mL续滤液，加50 %甲醇定容至50 mL。

1.3.3.2 不同料液比 取金银花粉末1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，温度设定为70℃，分别精密加入10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、60 mL 蒸馏水，各回流提取1 h。每处理提取2 次，合并提取液过滤定容至100 mL。精密量取1 mL 续滤液，加50%甲醇定容至50 mL。

1.3.3.3 不同回流时间 取金银花粉末1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，温度设定为70℃，精密加入30 mL 蒸馏水，分别回流提取30 min、50 min、60 min、90 min、120 min。每处理提取2 次，合并提取液滤过定容至100 mL。精密量取1 mL 续滤液，加50%甲醇定容至50 mL。

1.3.3.4 不同回流次数 取金银花粉末1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，温度设定为70℃，精密加入30 mL 蒸馏水，回流提取30 min，分别回流提取1、2、3、4 次。过滤，分别精密量取0.40 mL、5.00 mL、5.00 mL、5.00 mL、5.00 mL 续滤液，定容至10 mL。

1.3.4 水回流提取工艺正交试验 根据单因素试验的结果，以提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）设计三因素三水平L9（34）正交试验，确定最佳提取工艺，试验设计见表1 和表2。取样品9 份，每份精密称取金银花粉末1 g，置圆底烧瓶中，按表2的实验条件进行实验。每处理提取2 次，合并提取液过滤定容至100 mL。精密量取1 mL 续滤液，加50 %甲醇定容至50 mL。

表1 水回流提取绿原酸因素与水平Table 1 Factors and levels for reflux water extraction of chlorogenic acid

表2 L9（34）正交试验设计Table 2 Orthogonal test

1.4 数据分析处理

采用Excel 2013 对实验结果进行统计分析，采用SPSS 软件13.0 对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 以水为溶剂的不同提取方法对绿原酸得率的影响

由图1 可知，以药典法中提取条件得到金银花的绿原酸提取得率为100%，分别计算3 种水提取方法对金银花中绿原酸的相对提取率大小依次为：回流法＞超声法＞煎煮法，其中，回流法的绿原酸相对提取率为84.89%±3.37%，显著高于其他两种提取方法（P＜0.05）。因而在以下的实验中，我们选取回流法提取进一步展开金银花水提取工艺研究。

图1 不同提取方法对绿原酸相对提取率的影响Figure 1 Effect of different extraction methods on yield of chlorogenic acid

2.2 水提回流法提取工艺中不同因素对绿原酸得率的影响

2.2.1 回流温度对绿原酸得率的影响 由图2 结果表明，在其他条件相同的情况下，温度会影响金银花水提取绿原酸的效果，整体上，随着温度的上升，绿原酸的相对提取率呈先升后降的趋势。从60℃开始，随着温度的上升，绿原酸的相对提取率逐渐增大，到70℃时，绿原酸的相对提取率达到峰值，为80.86%±3.02%之后，随着温度的进一步升高，绿原酸的相对提取率反而下降，可能是因为温度过高导致绿原酸分解，致使绿原酸的相对提取率降低。因此，选择70℃左右作为回流法提取金银花中绿原酸的最佳温度。

图2 不同回流温度对绿原酸提取率的影响Figure 2 Effect of reflux temperature on yield of chlorogenic acid

2.2.2 液料比对绿原酸得率的影响 从图3 可以看出，整体上，随着液料比的增加，绿原酸的相对提取率呈先升后降，达到一定液料比后趋于平缓的趋势。从10 mL·g-1开始，随着液料比的增大，金银花绿原酸的相对提取率逐渐增大，到液料比为30 mL·g-1时，绿原酸的相对提取率达到峰值，为81.61%±3.24%，之后，随着液料比的进一步增大，绿原酸的相对提取率反而下降，至40 mL·g-1时，绿原酸的相对提取率逐渐趋于平缓，这可能是因为随着液料比的增大，绿原酸的溶出越来越多直至达到提取极限；继续增加液料比反而稀释绿原酸浓度，增加杂质溶出率，从而引起绿原酸得率下降。所以，30 mL·g-1左右为最佳提取料液比。

图3 不同液料比对绿原酸的提取率的影响Figure 3 Effect of liquid-solid ratio on yield of chlorogenic acid

2.2.3 回流时间对绿原酸得率的影响 由图4 表明，随着回流时间的增加，绿原酸的相对提取率先上升后下降。当回流时间为30～ 60 min 时，随着回流时间的增加，绿原酸的相对提取率逐渐增加，至60 min 时，绿原酸的相 对提取率达到峰值，为81.11%±3.22%，之后随着回流时间的增加，绿原酸的相对提取率反而下降。这可能是由于随着回流时间的延长，会引起部分绿原酸的分解，导致提取率的降低。为了节约时间降低能耗和减少有效成分的分解，选取回流时间为60 min 左右较为合适。

图4 不同回流时间对绿原酸提取率的影响Figure 4 Effect of reflux time on yield of chlorogenic acid

2.2.4 提取次数对绿原酸得率的影响 由图5 表明，在其他条件固定不变的情况下，回流2 次后，金银花中的绿原酸基本接近提取极限；继续增加提取次数不会显著增加其得率，反而会大大增加提取时间和能耗等综合成本，因此，水提取绿原酸工艺固定为回流2次比较合适。

图5 不同提取次数下绿原酸的提取率Figure 5 Effect of extraction numbers on yield of chlorogenic acid

2.3 回流提取工艺正交试验结果分析

根据表3 正交试验结果中极差R的大小可知，对金银花中绿原酸的得率影响最显著的是因素C 液料比，其次为因素B 回流时间，因素A 温度的影响最不显著。因此，采用水提回流法提取金银花中的绿原酸时，应最大限度地控制好液料比，回流时间和回流温度适中，以减少生产成本及降低绿原酸的损失，简化生产工艺。由上述分析结果可以推导出，最佳提取工艺的条件为A2B2C2，即回流温度为75℃，回流时间为60 min，液料比为25 mL·g-1。根据优化所得最佳提取条件，平行提取3 份，在该条件下绿原酸的相对提取率为97.22%±0.84%。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal test

3 结论与讨论

绿原酸是金银花的主要有效成分，具有多种生物活性和极高的药用和经济价值，其提取与利用技术研究一直备受关注，世界范围中国、美国、日本、欧洲申报相关的专利已超过800 件，被广泛应用到人用药、保健品、化妆品、饮料、饲料、兽用药、植物生长剂等行业[10]。已有关于金银花绿原酸提取文献报道也涉及多种不同工艺技术。王鑫等[11]优化得到55%乙醇回流法提取绿原酸的最佳提取条件：乙醇体积分数为55%，液料比为40 mL·g-1，回流时间为60 min，提取温度为60℃，在此提取条件下，绿原酸的得率为11.0%。刘金磊[12]等以70%的乙醇为提取剂得到金银花中绿原酸提取的最佳条件：料液比为1∶25，pH 值为6.0，提取温度为60℃，提取时间为60 min。李杰等[13,20]应用反应釜分别采用溶剂热和水热法优化提取金银花绿原酸工艺，结果表明，溶剂热法提取绿原酸的最佳提取工艺条件为甲醇浓度为50%，提取温度为110℃，提取溶剂pH 值为6.0，提取时间为30 min；绿原酸水热法提取的最佳条件：液料比为20 mL·g-1，提取温度为120℃，提取时间为20 min。浦娜娜等[21]通过响应面优化得到超高压处理提取金银花绿原酸的最优条件：提取压力为325 MPa，保压时间为10 min，提取时间为2 h，液料比为10 mL·g-1，乙醇浓度为60%。李华生等[22]采用高压反应釜优化得到加压辅助同步提取金银花中总黄酮和绿原酸的最佳工艺条件：甲醇浓度为60%，液料比为20 mL·g-1，提取压力为2 MPa，提取时间为30 min，提取温度为70℃。周慧燕等[15]优选出[C4mim][BF4]的离子液体水溶液提取金银花绿原酸工艺：离子液体与水体积比为4∶11，液料比为30 mL·g-1，400 W 微波提取为2.5 min。此外，周慧燕等[17]建立以氯化胆碱/尿素低共熔溶剂提取金银花中绿原酸的新方法，通过单因素和正交试验结果得到绿原酸提取的最佳工艺：液料比为25 mL·g-1，水浴温度为70℃，提取时间为60 min。综合以上文献可知，最佳工艺的主要考察因素范围：液料比为10～ 30 mL·g-1，提取温度为60～ 120℃，提取时间30～ 120 min，得到金银花绿原酸得率为3%～ 11%，存在较大差异，主要原因是所用实验材料不同所以无法直接比较；由于它们大都采用有机溶剂或新型溶剂或特殊设备，因而对生产条件和设备均具有一定要求。

本实验以水为提取溶剂，研究表明，水提回流法对金银花中绿原酸的提取率优于煎煮法和超声法；进一步综合单因素和正交试验结果，优化得到回流法提取金银花中绿原酸的最佳工艺条件为：提取温度为75℃，提取时间为60 min，液料比为25 mL·g-1，提取次数为2 次，与文献报道的其他提取最佳工艺的因素参数比较接近，在该条件下绿原酸的相对提取率达到97%以上。相较于传统乙醇、甲醇有机溶剂及一些新型提取溶剂，水是一种安全、环保、廉价的提取溶剂，此外水提回流法对设备要求相对简单、成本较低，且该法较煎煮法和超声法的溶剂耗用量少，因为溶剂能循环使用，有效成分浸出较完全，因而本研究结果为金银花绿原酸提取提供了一种较为简便与高效的方法，将为金银花在种植产地的加工与综合开发利用提供有益参考。