大鼠酒精中毒性脑病线粒体膜通透性改变机制研究

贾明月，李 丽，张 馨，刘杜鹃，霍世会

(1.吉林省人民医院 神经内科，吉林 长春130021；2.吉林市化工医院 烧伤整形科)

酒文化已然成为人们在社会交际活动中必不可少的一项文化，而因长期大量饮酒、酗酒、嗜酒所引发的酒精中毒性疾病也在逐年升高，威胁人们的生命健康及生活质量。据流行病学调查显示，在我国酒精滥用现象亦呈增长趋势，酒精中毒的患病率为31.7%，并呈现年轻化趋势[1]。本研究通过制备大鼠酒精中毒模型，探讨酒精中毒后导致线粒体膜通透性改变的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1动物模型制备及分组 成年雄性Wistar大鼠60只，每笼5只分笼饲养 ，在稳定室温及湿度条件下，用平衡饲料(吉林大学医学动物实验研究中心提供)喂养，自然饮水；参照贾明月等[2]大鼠酒精中毒模型制备方法，雄性 Wistar大鼠正常喂养1 w后开始造模。酒精中毒组(40只)： 每日每只大鼠分别按 8 ml/kg灌胃2 w，随后再按照 10 ml/kg灌胃 1 w，按 12 ml/kg灌胃 1 w，共灌胃 4 w。每日灌胃两次，其间隔均为 6 h。酒精浓度为 50%，是以无水乙醇加等量蒸馏水配置而成。盐水对照组(20只)：同时用等量的生理盐水进行灌胃。

1.1.2脑组织提取 4 w后2组大鼠取脑组织，匀浆后将细胞悬液移至离心管内加入10%DMEM培养基至8 ml，以1 000 rpm离心5 min。弃上清，重悬细胞后，接种于50 ml塑料培养瓶中，并置于5%CO2、90%湿度、37℃培养箱中培育。2-3天更换10%DMEM培养基一次，2-3次换液。

1.2 方法

1.2.1一般情况 每周测定大鼠体重变化情况，观察其毛发、进食量、排尿量、排便量等一般营养状态，并观察是否合并有脑血管意外等神经系统损伤的表现，如：偏瘫、抽搐发作等。

1.2.2活性氧(ROS)水平变化检测 应用荧光试剂DCFH-DA在流式细胞仪下检测ROS生成的相对量。在流式细胞仪下，将两组细胞按照1×105个/ml接种于6孔板，每组加入等量DMEM 稀释的DCFH-DA，其终浓度为 20 nM。在培养箱中孵育30 min，选择激发波长为485 nm、接收波长为530 nm，通过流式细胞仪检测各组荧光强度，获得ROS生成量。

1.2.3超氧化物歧化酶(SOD)活性变化检测 应用WST-1的显色反应在分光光度仪下通过比色来检测细胞内SOD活性。按照说明书配制SOD活性测定储液，分别将酒精组及对照组管内加入试剂一(双蒸水)1.0 ml，分别在酒精组管内加入上清液0.2 ml，对照管加入等量蒸馏水；于酒精组管及对照组管内加入试剂二(酶工作液)、试剂三(酶稀释液)、试剂四(底物应用液)各0.1 ml，漩涡混匀器充分混匀，置于37℃恒温水浴中50 min，后各管待测样品均加入2 ml显色剂；充分混匀，室温静置10 min，于波长550 nm，光径1 cm测定各管OD值，按照公式计算SOD活性。

1.2.4丙二醛(MDA)含量变化检测 应用TBA的显色反应在分光光度仪下通过比色来检测细胞内MDA含量。按照说明书配制MDA含量测定储液，将0.2 ml的10 nmol/ml标准品、无水乙醇、上清液加入测定管和标准管，在测定管、对照管分别加入试剂一(酶标工作液)、试剂二(底物显色液)分别为0.2 ml、3 ml；在各管中加入试剂三(终止液)1 ml，测定空白管中加入50%冰醋酸1 ml；漩涡混匀，封紧试管口，95℃恒温水浴40 min，后取出，冷却。以4 000 rpm离心10 min，提取上清于波长532 nm，光径1 cm处测定OD值。按照公式计算MDA含量。

1.2.5ATP含量变化测定 在分光光度仪下通过比色反应来检测细胞内ATP含量变化。将空白管、标准管各加入1 mmol/L标准液，测定管及对照管中分别加入样本30 μl；在上述各管中加入试剂一(底物液Ⅰ)100 μl、试剂二(底物液Ⅱ)200 μl；在标准管、测定管中各加入试剂三(促进剂)30 μl，在空白管、对照管中各加入双蒸水30 μl。混匀后置于37℃恒温水浴30 min，将试剂四(沉淀剂)各50 μl加入各管，混匀，4 000 rpm离心5 min；将试剂五(显色液)500 μl加入各管中取上清液300 μl，混匀后室温静置2 min后，上述各组加入试剂六(终止剂)各500 μl，混匀，室温静置5 min，在636 nm处0.5 cm光径，双蒸水调零，测定各管OD值。按照公式计算ATP含量。

1.2.6线粒体膜通透性转换孔(MPTP)通透性变化检测 钙黄绿素-AM是可进入线粒体膜内的荧光探针，钙黄绿素易被线粒体俘获，在一定条件激发下呈绿色荧光，一旦线粒体膜通道孔瞬时开放，钙黄绿素释放，可被胞浆中钴离子淬灭，而绿色荧光减弱或消失，通过荧光标记MPTP的方式标记线粒体膜通透性开放情况。将酒精组细胞按照5×104个/ml接种于24孔板，每孔1.5 ml。分别处理2组细胞，弃去细胞培养液，沿着孔壁加入10 μl 37℃预热的Reagent A到各组细胞培养孔，弃去清理液；沿着孔壁加入100 μl GENMED 染色工作液到各组细胞培养孔，置于 37℃细胞培养箱里孵育20 min；弃去GENMED染色工作液，沿着孔壁加入500 μl 37℃预热的Reagent A到细胞培养孔。分别在激发波长488 nm，散发波长505 nm倒置荧光显微镜下观察、摄片。

2 结果

2.1 一般情况两组共60只 Wistar雄性大鼠经4 w灌胃造模后，存活56只。其中酒精组40只大鼠经4 w不同梯度酒精灌胃后存活38只，死亡率为 20%，无操作不当导致死亡。对照组20只大鼠经4w盐水灌胃后，存活18只，2只因为操作不当而导致死亡。实验组大鼠由于酒精刺激作用，并于 1 w后出现毛发杂乱无光泽、干枯，进食量逐渐减少等情况。3 w后实验组大鼠出现 脱毛、倦怠、消瘦、营养状态差，部分出现了脑血管意外等神经系统损伤的表现，如：偏侧肢体瘫痪、抽搐发作等。4 w后，两组大鼠的体重(g)存在明显的统计学意义差异(P<0.01)；对照组大鼠对于灌胃操作无明显不适，体重正常增长(见表1)。

表1 两组大鼠体重(g)变化比较

2.2 大鼠慢性酒精中毒后对SOD酶活性、MDA生成量、ATP含量及ROS生成量的影响

实验结果显示：与对照组相比，酒精组SOD活性明显降低，MDA的生成量明显增加，ATP含量明显降低，ROS的生成量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表2。ROS含量流式测定分析结果见图1。

表2 两组SOD、MDA、ATP、ROS含量变化

图1 ROS含量流式测定分析(A:对照组； B:酒精组)

2.3 大鼠慢性酒精中毒对线粒体膜通透性影响

在倒置荧光相差显微镜下观察发现：对照组细胞可见细胞形态较好，显示绿色荧光较亮，而酒精组荧光强度明显减弱，考虑为MPTP开放后大量钙黄绿素外流被钴离子淬灭所致，提示MPTP通透性增大，酒精中毒损伤了细胞线粒体的膜通道稳定性。见图2。

图2 MPTP荧光显微镜下摄片(×200)

3 讨论

研究证实慢性酒精中毒可导致大鼠中枢神经系统功能障碍，出现相对应部位神经系统症状的发生，启动神经元凋亡启动子，诱导病理性凋亡途径的过度发生、发展[2]。另外，有研究通过活体取脑测定慢性酒精中毒后大鼠脑组织Ca2+的含量明显增高，与钙神经素(CaN)的表达增多共同证实慢性酒精中毒后存在Ca2+异常转运，并出现钙超载，与CaN异常表达共同作用，介导慢性酒精中毒性脑病的发生。由此证实了慢性酒精中毒可导致神经系统损害、离子代谢紊乱、钙超载等改变[3]。而线粒体的氧化磷酸化过程是细胞高效产能过程，在此期间，伴随大量ROS 的释放，过量的ROS会引起线粒体损伤,释放促凋亡因子,引起细胞死亡[4]。

在生理条件下，线粒体MPTP直径约为0.2-0.3 μm，仅允许小分子量的溶质通过。在Ca2+、磷酸、ADP和ATP等作用下，MPTP呈现开关交替的状态，可能起着调节线粒体和胞浆之间物质流动的作用[5-6]。但在病理条件如氧化剂、ANT配体、Bax、Ca2+等物质诱导下，以ANT-VDAC-CyP-D为核心[4]的MPTP孔径明显增大，达到1.8-2.6 μm，MPTP大量开放，而且呈持续状态，从而造成线粒体内分子量低于1.5 kD的溶质通过MPTP流入胞浆，引起线粒体肿胀、内膜电位丧失[7]、坏死。

本次研究发现的线粒体损伤途径靶点，线粒体在以ANT-VDAC-CyP-D为核心的MPTP调控下，完成生物膜功能及离子等小分子转运。本研究发现在病理性刺激作用时，比如酒精中毒的长期、慢性刺激，使得细胞内产生大量氧自由基，而抗氧化剂物质用于清除氧自由基时被大量消耗，使得机体稳态失衡，导致MPTP异常开放，线粒体发生代谢障碍。本研究发现酒精组ROS生成量明显高于对照组，推测ROS的过度生成是导致MPTP异常开放的诱因。并且发现产生的自由基也可使线粒体内的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，产生MDA与膜蛋白的游离氨基酸或磷脂分子缩合生成无生物活性的大分子产物，使膜流动性进一步下降，通透性增加，恶性循环，导致线粒体肿胀、功能障碍。本研究中亦发现酒精组的SOD产生较对照组明显减少，而酒精组的MDA含量明显较对照组增多，验证慢性酒精中毒后线粒体内MPTP的改变与SOD、MDA、ROS含量变化的重要关系，说明线粒体转运通道的改变是慢性酒精中毒后中枢神经细胞损伤机制和途径。