食管胃交接部腺癌患者T细胞表达与病理参数及淋巴结转移的关系研究

李东辉,李 杰,王艳伟

(邯郸市第一医院纺医院区 综合外科，河北 邯郸056004)

食管胃交接部腺癌(AEG)位于食管、胃的移行区，兼有食管癌与胃癌的特征，该部位的腺癌可侵入贲门，并由贲门癌向上侵入食管下段，导致交接部癌、食管腺癌、贲门腺癌的重叠性发生，病情复杂、肿瘤分类错综[1-2]。AEG发病因素众多，目前比较明确的有肥胖、Barrett食管、胃食管反流，手术治疗是本病的主要治疗手段，其中根治切除(在保证安全的基础上完全切除原发肿瘤及彻底清扫可能转移的区域淋巴结)是目前最有效的方式，然而AEG特殊的生物学行为使得单纯手术治疗的5年生存率仅为10%-38.7%之间，70%的患者发生了胸膜、肝脏、腹膜的转移[3-6]。有研究显示，AEG在早期发生淋巴结转移则5年生存率一般低于30%，若在进展期发生淋巴结转移则5年生存期<15%[7-8]。20世纪末，有实验发现人体内存在由肿瘤引发的T淋巴细胞亚群抑制抗肿瘤免疫反应，且随着调节性T细胞(Treg)被认识，免疫系统在监控肿瘤发生发展中的意义日渐显著[9-10]。肿瘤发生时，人体免疫耐受、抑制抗肿瘤免疫效应等被激活，继而发生免疫抑制现象。本研究采用免疫组化分析法对AEG患者的T细胞进行观察，探讨免疫系统与AEG发生发展间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2013年1月至2016年6月邯郸市第一医院纺医院区收治的AEG患者120例为研究对象。其中，男性90例，女性30例；年龄40-74岁，平均(60.57±8.47)岁；肿瘤最大直径1.0-20.0 cm，平均(6.04±0.07) cm；根据国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会的TNM分期标准，Ⅰ-Ⅱ期患者85例，Ш期患者35例；组织学分化中高分化者62例，低分化者58例。根据标本采集部位对患者进行分组，AEG组取食管胃交接部腺癌标本，共70例；对照组取肿瘤组织旁2-3 cm范围内的正常组织，共50例。纳入标准：根据《食管胃结合部腺癌外科治疗中国专家共识》[11]关于AEG的诊断标准,以及超声内镜、病理学确诊；患者术前均未进行过放化疗和其他抗癌治疗。排除标准：既往进行过手术、放化疗而复发的AEG患者，预估生存期<3个月的AEG患者，合并有其他恶性肿瘤者，具有严重心脑血管、肝肾功能衰竭者。所有入选者及其家属均对本研究内容知情、了解，并签署知情同意书；本次研究经医院医学伦理委员会批准开展。

1.2 方法

1.2.1免疫组化法步骤 对手术中采集的标本进行多聚甲醛固定、石蜡包埋，并连续切片，HE染色核实病理诊断。采用免疫组化SP法对CD8、Foxp3进行染色，具体步骤为：组织切片，70°温箱中烤片3-12 h，脱蜡、水冲洗3 min，切片置于湿片盒中PBS冲洗，高温水浴法抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，切片置于湿盒中PBS冲洗，滴加一抗，湿盒放置常温下15 min，PBS冲洗，滴加二抗，PBS冲洗，显色，25℃下苏木素染色5 min，75%乙醇0.5 min 1次、95%乙醇0.5 min 1次、100%乙醇0.5 min 1次、二甲苯3 min 2次后树脂封片。

1.2.2结果判定 400高倍镜下对每张切片随机选择6个视野肿瘤细胞进行观察，采用半定量计分法进行判定，0分为阳性细胞比例≤5%、1分为阳性细胞比例>5%且≤25%、2分为阳性细胞比例>25%且≤50%、3分为阳性细胞比例>50%且≤75%、4分为阳性细胞比例>75%。阳性细胞判定：细胞质出现棕褐色、黄色颗粒为CD8阳性，细胞核出现黄褐色或黄色颗粒为Foxp3阳性。实验中由两位病理科医师采用双盲法进行读片。

1.3 统计学方法

采用SPSS18.0统计学软件对收集到的数据进行分析，计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AEG组与对照组中CD8+与Foxp3的表达比较

从表1可以看出，AEG组的CD8+阳性率为58.57%(41/70)、Foxp3的阳性率为74.29%(52/70)，对照组的CD8+阳性率为4.00%(2/50)、Foxp3的阳性率为14.00%(7/50)。组间比较，AEG组的CD8+与Foxp3阳性率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

在肿瘤组织中CD8+与Foxp3均呈阳性表达的患者进行统计。AEG组中同时阳性表达的为29例，阳性率为41.43%；同时呈阴性表达的为2例，阴性率为2.86%。Foxp3为阳性表达、CD8+为阴性表达的为25例，CD8+为阳性表达、Foxp3为阴性表达的为14例。

表1 AEG组与对照组CD8+与Foxp3的表达

2.2 AEG组患者CD8+及Foxp3表达与临床病理关系

在AEG组中TNM分期的Ⅰ-Ⅱ期患者共40例，Ⅲ期患者30例；组织学分化中高分化者33例，低分化者37例；发生淋巴结转移共43例，未发生淋巴结转移者27例。

CD8+在TNM分期中Ⅰ-Ⅱ期的阳性率为50%(20/40)、Ⅲ期为76.67%(23/30)；Ⅰ-Ⅱ期与Ⅲ期比较差异显著(χ2=5.145，P<0.05)。CD8+在中高分化组织中的阳性率为42.42%(14/33)、低分化的阳性率为59.46%(22/37)；中高分化与低分化比较差异不显著(χ2=2.026，P>0.05)。CD8+在发生淋巴结转移组的阳性率为55.81%(24/43)，未发生淋巴结转移组的阳性率为29.63%,两组比较，差异有统计学意义(χ2=4.214，P<0.05)。

Foxp3在TNM分期中Ⅰ-Ⅱ期的阳性率为55%(22/40)、Ⅲ期为90%(27/30)，Ⅰ-Ⅱ期与Ⅲ期比较差异显著(χ2=10.000，P<0.05)。Foxp3在中高分化组织中的阳性率为51.52%(17/33)、低分化的阳性率为70.27%(26/37)，中高分化与低分化比较差异不显著(χ2=2.590，P>0.05)。Foxp3在发生淋巴结转移组的阳性率为76.74%(33/43)，未发生淋巴结转移组的阳性率为37.04%，两组比较，差异有统计学意义(χ2=24.605，P<0.05)。见表2。

表2 CD8+与Foxp3在AEG组表达与临床病理的关系

2.3 AEG组患者CD8+与Foxp3表达与5年生存率关系

本研究中AEG组患者经腹入路行根治性切除术，5年及以上生存者17例，5年以下生存者为53例。生存期<5年的CD8+表达阳性率为37.74%(20/53)，≥5年的CD8+表达阳性率为41.18%(7/17)；生存期<5年与≥5年的CD8+表达阳性率比较差异不显著(χ2=0.064，P>0.05)。生存期<5年的Foxp3表达阳性率为69.81%(37/53)，≥5年的Foxp3表达阳性率为23.53%(4/17)；生存期<5年与≥5年的Foxp3表达阳性率比较差异显著(χ2=11.362，P<0.05)。见表3。

表3 CD8+与Foxp3表达与AEG组患者5年生存率关系

3 讨论

免疫耐受、免疫逃逸在肿瘤发展过程中发挥着重要作用，其相关作用机制的研究已十分广泛。Treg是一群同时具有免疫抑制和免疫低反应的T细胞亚群，在维持外周免疫耐受、预防自身免疫性疾病、阻断移植排斥反应中均发挥着重要作用。Treg对T细胞应答具有较强的抑制作用，在抵抗机体抗肿瘤免疫中具有重要作用，是肿瘤免疫逃逸的重要因素。有研究认为，Treg通过穿孔素-颗粒媒介的细胞毒作用、细胞表面表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原、转化生长因子-β、白介素分泌等途径实现免疫抑制[12-14]。抗原Foxp3是Treg的特异性标志物，有研究显示Treg弥散分布在CD8+T细胞区域[15]，故在本次研究中选择CD8+、Foxp3作为AEG患者的主要观察指标，探讨T细胞表达与本病病理特点、预后的关系。

从本次研究结果来看，CD8+与Foxp3在AEG肿瘤组织中的阳性率均明显高于癌旁的正常组织，其中Foxp3表达阳性较高，且在对CD8+与Foxp3两项同时观察时，两者同时为阴性的占比仅为2.86%，说明CD8+与Foxp3在特定区域腺癌中具有高表达特征，尤以Foxp3阳性表达为显著。有学者在对肝癌小鼠进行观察时发现，肿瘤引流淋巴结内CD8+T细胞在体外刺激分泌IFN-γ的功能可恢复，由于Treg常弥散在CD8+T细胞区域，因此推测肿瘤组织中Treg通过抑制CD8+T细胞来促进肿瘤发展[16-17]。从病理关系来看，CD8+与Foxp3均在TNM分期中Ⅲ期阳性表达性较高，说明二者在辨别AEG分期、组织学中具有重要意义。

胃与食管结合部解剖部位特殊、淋巴引流复杂，有统计显示AEG的淋巴结转移率高达57%-79%[18]；张彦军[19]在对393例AEG患者进行病理学特征观察时发现，275例患者发生了淋巴结转移，转移率为70%。淋巴结转移是影响肿瘤患者预后的重要影响因素，对AEG患者淋巴转移规律的研究十分重要。在本次研究中，淋巴结转移患者的CD8+、Foxp3阳性率均高于未发生淋巴结转移的患者，且在淋巴结转移患者中Foxp3阳性率最高。在对患者进行5年生存期观察时发现，AEG患者生存期<5年的Foxp3阳性率较高，说明该指标对预测AEG患者预后具有一定参考性。相关研究显示，肺癌患者的Foxp3表达参与了抑制肿瘤特异性T细胞增殖的过程，在胃肠道恶性肿瘤晚期患者血液中Treg含量明显高于早期患者，这些结果与本研究共同说明Treg在推动肿瘤发展中具有重要作用，是影响肿瘤患者预后的重要因素。

综上所述，AEG肿瘤组织中CD8+与Foxp3均有较高的阳性率，且以Foxp3表达最为明显，二者对于判断AEG患者预后具有一定价值。在接下来的研究中，拟对多中心AEG患者的肿瘤病理表现与T细胞关系进行观察，进一步探讨AEG发展特点与机制，为临床治疗提供更具针对性的理论依据。