单宁酸在抗菌及伤口愈合中的研究进展

常丽，陈安国，黄思齐，李建军，唐慧娟，潘根，邓勇，张翠萍，李德芳，赵立宁

（中国农业科学院麻类研究所/农业农村部麻类生物学与加工重点实验室，湖南 长沙 410205）

在日常生活中，人们不可避免地要接触到各种各样的细菌、真菌等微生物，这些微生物在适合的环境条件下会迅速生长繁殖，并通过接触传播疾病，影响人们的身心健康和正常的工作、学习和生活。世界范围内，因细菌传染而引起的霍乱、肺炎、疟疾、结核病和肝炎等导致人类死亡的事件频频发生，触目惊心。随着人民生活水平的不断提高，人们对生活质量、环境卫生日益重视，抗菌问题也随之受到世界各国的高度重视。降低和有效防止环境中各种病原微生物对人类健康造成的影响和危害，逐渐成为社会的共识。

人的皮肤是一种很好的营养基，而各种各样的纺织品是细菌的优良寄居地，更是疾病的传播源。抗菌纤维作为重要的功能纺织材料，具有防止细菌滋生、阻断疾病传播、保持人体清洁卫生和防止纺织品变质变色等作用，特别适用于作战、执勤、消防和救灾等从事特殊工作的人群。人的皮肤亦是隔绝和保护人体免受外界刺激性伤害的第一道防线。当皮肤受到伤害时，伤口会迅速止血，闭合受损的皮肤会迅速再生，从而再次起到屏障的作用。伤口的修复过程是一个复杂的动态过程，正常的伤口愈合通常会在两周内完成创伤修复过程。伤口愈合最需要解决的问题是通过各种手段延缓愈合过程中的细菌感染。研究表明，单宁酸因其独特的结构特性，尤其对多种病菌具有较强抗菌功能性，同时能促进细胞增殖、组织再生和伤口愈合，被广泛用于生物材料的改性［1］。本文就单宁酸抗菌及加速伤口愈合的研究做一综述，以期为单宁酸作为功能成分用于生物医用材料的改性提供翔实的参考依据。

1 单宁酸的结构与性质

单宁酸（Tannin acid，TA）又称鞣酸、单宁，是一种天然高分子量的水溶性多酚，具有较高生物安全性，来源丰富，广泛存在植物中，如：中国五倍子、豆类、谷类、石榴、苹果、香蕉、柿子、金缕梅、漆树叶和塔拉果荚等［2］。单宁酸的化学式为C76H52O46，其分子结构如图1所示，是由一个葡萄糖核的五个羟基与没食子酰基通过酯键结合形成。常温常压下，单宁酸主要以固体粉末的形式保存，颜色呈淡黄，但会随着氧化而逐渐加深至浅棕色。单宁酸可以溶于水、乙醇、丙酮中，但不溶于氯仿、石油酸、乙醚。

图1 单宁酸的分子结构Fig.1 The molecular structure of tannic acid

单宁酸属于多酚类化合物的一种，是典型的葡萄糖梏酰基化合物。单宁酸多酚羟基的结构赋予其突出的化学性质。（1）单宁酸与蛋白质、生物碱、多糖、核酸的相互作用：目前，提出多酚与蛋白质的作用机制主要包括静电吸附、多点氢键、疏水结合及疏水-多点氢键协同作用。最为公认的是由Haslam等［3］于1988年提出的疏水-多点氢键协同作用机制，他认为多酚和蛋白质的结合存在两个阶段，首先，当多酚靠近蛋白质时，由于疏水作用，多酚优先向蛋白质分子链上的疏水残基区域接近，同时这些区域的氨基酸侧链在多酚分子周围紧密排列形成疏水“口袋”，然后，多酚分子表面和蛋白质分子链上的氢键结合位点（如：胍基、酰胺键、氨基、羟基和羧基）间形成密集的氢键稳定多酚的位置，最终形成一种可逆的复合物。由于蛋白质表面水分子层减少，最终发生聚集和沉淀。在该过程中，多酚相当于多齿配体（拥有多个酚羟基），蛋白质则是一个多齿受体分子。这就是著名的“手套-手”动态模型。蛋白质和多酚的结合能力受二者分子量和分子结构的影响。单宁酸既有疏水性的醅酰基，又有亲水性邻位酚羟基，因此，它和蛋白质、生物碱、多糖、核酸等多种生物大分子能发生上述类似的疏水-多点氢键协同［4］。（2）单宁酸与金属离子的螯合反应：单宁酸同时具有大量邻苯二酚和邻苯三酚结构，能与多种金属离子相互作用形成螯合物。当单宁酸与二价金属离子反应时，相邻的两个酚羟基以氧负离子的形式与同一个金属离子通过配位键形成稳定的五元环结构；邻苯三酚结构上的第三个酚羟基并不直接参与螯合反应，而是促进另外两个相邻酚羟基解离形成氧负离子，间接地促进螯合物的形成和稳定，最终以沉淀的形式在溶液中沉积。Guo等［5］报道，单宁酸可与铝（Al）、钒（V）、铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、钴（Co）、镍（Ni）、铜（Cu）、锌（Zn）、锆（Zr）、钼（Mo）、钌（Ru）、铑（Rh）、镉（Cd）、铈（Ce）、铕（Eu）、钆（Gd）、铽（Tb）等 18种金属离子配位形成稳定的配位化合物，而不同的金属离子与单宁酸会形成不同颜色的沉淀物。（3）单宁酸的衍生化反应：单宁酸分子中的苯环使其具有一定的疏水性，但苯环上丰富的酚羟基使整个分子表现为更强的亲水性，从而阻碍了单宁酸与疏水化合物的反应。例如：在生物体内，单宁酸的苯环骨架可以与细胞膜磷脂分子的极性端发生相互作用生成复合物，所以难以跨越磷脂双分子层，导致单宁酸难以进入细胞内发挥生理活性。因此，为了拓展单宁酸的应用领域并充分发挥其作用，常常通过衍生化反应，如：酯化、磺化、酰基化、醚化、亚硫酸化及偶氮化反应等对单宁酸分子进行改性［4］，以满足其各种场合的需求。

2 单宁酸的抗菌研究进展

单宁酸表现出很强的抗菌活性主要因为其结构中含有许多酚羟基。研究表明，从许多植物中提取的单宁酸具有优异的广谱抗菌活性［6-9］，其抗菌活性取决于提取条件，如：pH、温度、时间及溶剂种类等［10-11］。而大多数单宁酸显示的是抑菌活性而不是杀菌活性［12］，其最小抑菌浓度MIC的范围在15～3200 ug/mL。尉骁等［13］测试了单宁酸对9种临床常见菌的抗菌活性，并将每种菌分为多重耐药组和非多重耐药组。结果显示，单宁酸对这9种致病菌均有一定的抗菌活性，对葡萄球菌属的抗菌活性高于革兰氏阴性菌的抗菌活性，尤其是单宁酸能抑制多重耐药细菌的生长。郑正男等［14］测试了单宁酸对6种食品中常见腐败菌的抗菌活性。结果显示，单宁酸比常见食品防腐剂山梨酸钾的抗菌效果好，且酸性环境更利于单宁酸抗菌活性的发挥，而氯化钠、蔗糖、金属离子的添加均会降低单宁酸的抗菌活性。Pandey等［15］从团花树果实中提取的单宁酸对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和英诺克李斯特菌有良好的抗菌活性。

目前，提出的单宁酸抗菌机制主要包括：（1）妨碍细菌对铁、多糖、氨基酸等摄取。铁是细菌生长必不可少的营养因子，同时参与核苷酸前体的还原反应。细菌自身能产生一种铁载体，能够结合外部环境中的铁离子。与天然铁载体相比，单宁酸显示出更高的铁结合效率［16］。单宁酸分子结构中的邻二羟基苯基优先与铁离子螯合，使细菌无法从周围环境中摄取并螯合铁离子，则生长受抑制。Bag等［17］证实了从柯子果实中提取的没食子单宁酸（1，2，6-tris-O-galloyl-β-D-glucose）对多药耐药性尿路致病菌的抗菌活性是由于单宁酸与铁螯合妨碍了病菌对铁的摄取而使其生长受限。此外，Engels等［16］发现丹宁酸与铁的螯合效率与没食子酰基数量呈负相关，由于空间效应，酰基化程度的增加降低了单宁酸与铁的螯合能力。Pandey等［15］发现单宁酸是通过对糖和氨基酸的摄取（即疏水-多点氢键协同作用）从而抑制细菌的生长。但乳酸菌的生长无须铁质，因此，乳酸菌对单宁酸的敏感性较低。Chung等［18］研究表明单宁酸对嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌的MIC＞500 ug/mL。Chan等［19］比较了巴东肉桂、中国肉桂、牛至、虎杖、石榴皮和丁香6种食用香料及药材的多酚提取物（包括：单宁酸、丁香酚、肉桂醛等）对食源性致病菌蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒杆菌、弗氏志贺氏菌及嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的抗菌活性，结果显示，所有多酚提取物对食源性致病菌具有明显的抗菌活性，但无法抑制乳酸菌的生长。（2）破坏细菌细胞壁及细胞膜。细菌细胞壁由肽聚糖、N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸的重复亚单位通过短肽键连接组成，能保护细菌细胞免受周围环境的影响并维持细菌形状的完整性。Dong等［20］研究了单宁酸对金黄色葡萄球菌的抗菌活性及作用机制，推测单宁酸通过与细胞壁的肽聚糖结合而破坏细胞壁完整性。单宁酸与细菌细胞膜相互作用，通过影响膜电位或增加膜通透性实现其抗菌作用。Tian等［21］报道了单宁酸通过氢键直接与细菌膜蛋白相互作用，抑制鼠伤寒沙门氏菌和蜡状芽孢杆菌的生长，导致细胞膜通透性改变从而使细菌死亡。Wang等［22］研究了三叶草中的单宁酸对大肠杆菌的抑菌活性，50 ug/mL的单宁酸能降低细胞外膜不饱和脂肪酸与总脂肪酸的比例，透射电子显微镜直观地显示了单宁酸作用后的大肠杆菌外膜结构遭到破坏，即单宁酸通过改变外膜脂肪酸的组成和破坏细胞外膜形态而实现其抗菌作用。（3）抑制生物膜的形成。生物膜是细菌生存的一种优势生活方式，细菌通过产生胞外基质将细菌群体包裹起来，阻隔抗菌剂及免疫清除作用，细菌一旦形成生物膜，其耐药性将会增加几倍甚至几十倍。尉骁等［13］研究表明，0.08 mg/mL的单宁酸能使细菌形成生物膜的数量明显减少；Samoilova等［23］研究表明，单宁酸能够抑制大肠杆菌及其突变体（除鞭毛合成缺陷菌株）生物膜的形成，从而表现出有效的杀菌作用。

3 单宁酸加速伤口愈合的研究

伤口愈合目前仍是一个具有挑战性的临床问题。在伤口愈合过程中，损伤和暴露的组织很容易遭受细菌感染，抑制伤口愈合，甚至导致愈合停止，并伴随一系列慢性疾病的发生。伤口愈合要解决的关键问题是通过各种手段降低愈合过程的感染。单宁酸除了良好的抗菌性能外，还能作为一种收敛剂，加速体外和体内伤口愈合。自20世纪20年代以来，单宁酸就被用于治疗烧伤，能显著降低死亡率［24］。Chen等［25］研究表明，单宁酸能显著地促进大鼠伤口愈合和毛囊再生，对大鼠创面愈合具有良好的促进作用。其作用机制为：单宁酸刺激碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的分泌，激活细胞外信号调节蛋白激酶1/2（Erk1/2）信号通路，促进细胞増殖，从而达到促愈合的效果；同时，单宁酸能抑制NF-rB通路的激活来缓解创伤的炎症反应，并刺激巨噬细胞分泌外泌体，诱导纤维细胞的迁移和聚集，从而促进创面组织的再生。此外，为了提高创面修复效率，通常要求创面敷料要能够帮助细胞创造一个合适的再生环境，同时保护修复部位免受细菌攻击。水凝胶作为敷料的一种，除了为皮肤再生提供湿润的环境外，还可以吸收多余的渗出物。目前，已将单宁酸作为功能成分与水凝胶结合，制备了理想的伤口敷料。如：Zheng等［26］利用明胶基水凝胶在体温下与低含量的凝胶糖混合，通过生物聚合作用制备了可注射水凝胶，并将单宁酸作为功能成分掺入混合水凝胶中。试验证实负载单宁酸的混合水凝胶可加速小鼠模型的伤口愈合。Ninan等［27］制备了锌离子交联的pH响应羧化琼脂糖/单宁酸水凝胶，在酸性条件下水凝胶表现出最大的溶胀性，单宁酸可持续释放，显示出良好的抗菌和抗炎特性，并激活伤口修复过程。此外，Song等［28］通过单宁酸和Fe3+的螯合作用，将TA图层组装在石英/硅载玻片和医用纱布上，并研究该材料的止血性能。结果显示，金属有机物螯合TA涂层与医用纱布相比表现出更优异的止血性能。这可能是由于TA涂层介导的轻微溶血作用，以及TA涂层能吸附大量蛋白质，特别是纤维蛋白原转化为纤维蛋白，进一步诱导凝血酶催化血液凝固。该材料在伤口愈合等医疗应用方面显示出巨大的潜力。

4 展望

工业大麻（Industrial hemp）是我国传统的纤维作物，长期以来一直是主要的纺织原料，进入20世纪，由于合成纤维的出现，大大降低了对大麻纤维包括其他天然纤维的需求。近年来由于天然资源的优越性彰显，人们对生命健康的珍爱，对环境保护的积极参与，对绿色消费的渴求，使工业大麻纤维的本质属性与特征更加发挥到极致。与合成纤维相比，工业大麻纤维有难以比拟的优势：优良的吸湿、散湿、透气性，传热导热速度快，穿着凉爽挺括，出汗不贴身，面料质地轻及静电少、消音吸波、防紫外线、可降解等；与其他天然纤维相比，工业大麻纤维仍有难以比拟的优势：其生物量巨大，每公顷大麻纤维产量是棉纤维的3倍多，种植成本低且在种植期间极少使用杀虫剂，比棉纤维更加经济环保，而在众多麻纤维中，大麻纤维最细软（约为苎麻的1/3，与棉纤维接近）且末端呈钝圆状态，使大麻纤维纺织品没有其他麻纺织品的尖锐刺痒感。根据国内外相关研究报告，工业大麻韧皮纤维具有一定的抑菌性能，主要是由于纤维的中空多孔结构可破坏厌氧菌生存环境及韧皮纤维所含的大麻素等化学物质，但是纺织用大麻纤维必须经过脱胶、漂白、精梳等加工过程，该过程会导致大部分抑菌成分流失，造成梳理后麻纤维的抑菌性能减弱，无法满足人类对纤维的抗菌需求。单宁酸因其独特的结构特性，可以通过静电相互作用、氢键和疏水相互作用等多种反应途径与各种材料相互作用，赋予材料优异的抗菌及止血功能，并加速伤口的愈合。目前，单宁酸已被添加到不同的生物聚合物、胶原蛋白和多糖，如壳聚糖、琼脂糖和淀粉中。但仍未有将单宁酸结合大麻纤维制备医用材料的报道。因此，期望能将单宁酸应用于大麻纤维上，研发一种无毒副作用、高效、广谱抗菌且能加速伤口愈合的单宁酸改性大麻功能纤维材料，成为抗菌领域及伤口治疗领域中较有前景的新型医用材料。大麻纤维具有多孔的纤维形态，且分子结构中含有大量的羟基，能与丹宁酸表面丰富的酚羟基生成氢键，从而将丹宁酸吸附在麻纤维表面。但是，单宁酸与大麻纤维之间的氢键作用受使用环境影响较大，使用过程中不稳定、易脱落，如何将单宁酸稳定的共价接枝在大麻纤维的结构中，并保证单宁酸良好的抗菌活性及加速伤口愈合作用，有待于进一步地深入研究。