广西部分猪场猪流行性腹泻病毒S基因克隆及序列分析

李春英，何奇松，冯淑萍，杨可妍，曾咏芳，熊 毅，颜健华

(1.广西大学医学院，广西南宁 530005；2.钦州市动物疫病预防控制中心，广西钦州 535099；3.广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西南宁 530001；4.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005)

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)属于冠状病毒科的成员，引起猪特别是仔猪的急性肠道传染病[1-2]。20世纪70年代，英国首次报道发现PEDV。随后欧洲其他国家以及中国、韩国和日本等亚洲国家的猪场也都暴发了猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)。2010年后，PED席卷全国各地的猪场，并且造成大量仔猪感染和死亡，而现有疫苗免疫保护性差[3]。各阶段的猪都可感染，而且日龄越小特别是哺乳仔猪发病率高，病死率也高[4]。目前，PED为我国养殖业严重的猪传染病之一[5]。因此，对PDEV流行株的S基因进行全基因克隆测序，研究广西当前流行的PEDV变异特征，对研发有效的PEDV疫苗和控制PEDV的流行具有重要意义。PEDV的S基因编码的蛋白为表面的糖基化纤突蛋白，与病毒适应外部环境的能力和宿主内毒力存在密切联系[6]。S蛋白可以调节病毒与宿主细胞特定受体之间的作用，是病毒侵入宿主细胞的媒介，刺激机体中和抗体的产生。S蛋白是一种Ⅰ型糖蛋白，有1383个氨基酸，含有1个信号肽、1个跨膜结构、4个中和抗原位点和1个结构域[7]。根据PEDV和其他冠状病毒S蛋白的同源性特征，将其S蛋白分为S1和S2两个区域。S1区域是1-789位氨基酸，S2区域是790-1383位氨基酸[8-10]。因此，研究S蛋白有助于在开发PEDV疫苗时候选择适宜的疫苗群。近年来PED在国内各养殖场感染情况增加，这可能提示PEDV已经产生了新的变种。一直以来，S基因是分析PEDV当前流行特点一个重要基因[11-12]。S蛋白的受体结合域和抗原表位与病毒入侵宿主和介导产生中和抗体存在着很大关联。本研究通过对当前流行毒株的全S基因进行克隆、测序，以了解广西地区PEDV流行特征和遗传进化树特点，为更好防控PEDV提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和病料 PEDV野毒株阳性病料由广西动物疫病预防控制中心家畜诊断科鉴定并保存；猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、PEDV、猪轮状病毒(G型)三联活疫苗作为实验阳性对照，哈尔滨维科生物技术开发公司产品；病料为广西7个市(县、地区)的25个猪场采集的疑似感染PEDV的猪淋巴结或者粪便。

1.1.2 主要试剂与仪器 RNA核酸提取试剂盒、通用型胶回收试剂盒、DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞、TIANprep Mini Plasmid kit质粒提取试剂盒，天根生化有限公司产品；限制性内切酶、抑制酶HIR、DNA Marker DL 2 000、反转录酶M-MLV、PMD-18T质粒载体、EXTaq，宝生物工程(大连)有限公司产品；PCR仪，SENSO公司产品；电泳仪和凝胶成像系统，北京市六一仪器厂生产。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参照PEDV经典毒株CV777株的S基因序列，利用Oligo引物设计软件设计了S1、S2、S3、S4和S5共5对引物对PEDV进行全S基因扩增，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物稀释成 25 pmol/μL后分装于-20℃冰箱保存备用(表1)。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.2.2 总RNA的提取 根据核酸抽提试剂盒的操作步骤提取病毒总RNA，最后溶于25 μL ddH2O，用于反转录合成cDNA或-20℃保存备用。

1.2.3 反转录合成病毒 cDNA将获得的病毒RNA根据M-MLV反转录酶产品说明书进行操作 ，获得的cDNA产物用于RT-PCR扩增或是-20℃保存备用。反转录体系：15.0 μL RNA模板，2.0 μL dNTPs，0.5 μL M-MLV，5.0 μL 5×buffer，2.0 μL下游引物，0.5 μL HIR。反转录程序：95℃ 5 min，反转录42℃ 1 h。

1.2.4 目的片段PCR扩增 分别用S1、S2、S3、S4和S5共5引物对S基因5个片段分别进行PCR扩增。PCR反应体系：2.0 μL dNTPs，2.5 μL 10×buffer，上、下游引物各0.5 μL，0.1 μL ExTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，最后加ddH2O补足至25.0 μL。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；95℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 40 s，进行35个循环；最后72℃ 10 min。目的产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.5 PCR产物回收、克隆和测序 根据操作规程用天根生化有限公司回收目标PCR产物，用pMD18-T载体与其连接后4℃过夜，然后转化到DH5ɑ感受态细胞中，涂于LA 培养基上，37℃培养12 h～16 h，挑取单个白色菌落，接至LB液体培养基，37℃摇床培养17 h。将获得的培养物2 mL提取重组质粒，双酶切及质粒PCR鉴定，筛选出两者均为阳性的菌株送宝生物工程(大连)有限公司测序。

2 结果

2.1 全S基因的RT-PCR扩增结果

用自己设计的5对引物对41株样品的S2、S1、S3、S4、S5进行扩增，所获得5个目标片段与预期的1 019、1 129、820、899、876 bp大小符合。将回收目标DNA克隆测序(图1)。

M.DNA Marker DL 2 000；1-5.S2,S1,S3,S4,S5图1 CHGXXA014-222012株的5个S基因片段扩增电泳Fig.1 The electrophoresis results of amplified fragments of CHGXXA014-222012 five S genes

2.2 酶切鉴定

将各片段扩增产物进行胶回收，与载体PMD18-T进行连接转化到DH5α感受太细胞，涂板，单个菌落培养，然后进行双酶切鉴定(图2)。

M.DNA Marker DL 2 000；1-5.S4,S2,S1,S3,S5；6.Negative control图2 CHGXXA014-222012株S基因5个片段酶切电泳Fig.2 The electrophoresis of CHGXXA014-222012 five fragments of S gene digested with restriction endonucleases

2.3 S基因序列同源性分析结果

对41份阳性样品进行全S基因测序，用生物软件将所有毒株的5个扩增片段进行拼接。结果显示，所得的广西PEDV全S基因存在核苷酸插入和缺失。核苷酸组成个数分别有4161、4158、4149、4176、4164、4140个。测序的41份样品的全S基因的核苷酸同源性在94.8%～100%。与Attenuated-DR13、CV777株、韩国株Spk1、HuN和日本株NK等参考毒株的核苷酸同源性见图3。

2.4 S基因遗传进化树

用生物软件DNAstar将本研究的41株S基因核苷酸与下载的PEDV参考株进化树图谱绘制(图3)。图谱显示，本研究的41株与65株参考毒株可分为3个谱系，Cluster1包含本研究的CHGXLC055-92013、CHGXLC055-52013、CHGXG P035-72013、CHGXGP035-82013共4株毒株和Attenuated-DR13、CV777等参考株。本研究剩余毒株和韩国株Spk1、HuN和日本株NK等参考毒株属于Cluster3。Cluster2只有Brl-87、KPED-9、JS-2004-2、DR13、LZC、Chinju99、CH-S、83p-5和MK等参考毒株。

图3 PEDV S基因进化树图谱Fig.3 Phylogenetic tree of PEDV S gene

本研究毒株所属的Cluster3与Cluster2 Brl-87、KPED-9、JS-2004-2、DR13、LZC、Chinju99、CH-S、83p-5和MK参考毒株核苷酸同源性为92.7%～96.3%；与Cluster1 CV777、Attenuated-DR13核苷酸同源性为92.8%～94.2%；与Cluster3韩国株Spk1、HuN和日本株NK等参考毒株核苷酸同源性为93.2%～99.4%。而本研究毒株所属Cluster1的毒株与Cluster2 Brl-87、KPED-9、JS-2004-2、DR13、LZC、Chinju99、CH-S、83p-5和MK参考毒株核苷酸同源性为92.5%～98.1%，与Cluster3韩国株Spk1、HuN和日本株NK等参考毒株之间的核苷酸同源性为92.9%～95.8%，与Cluster1 CV777、Attenuated-DR13之间核苷酸同源性为95.7%～97.5%。

2.5 抗原位点氨基酸变化情况分析

将获得的41株全S基因和CV777的氨基酸进行比对。结果显示，CHGXLC055-52013、CHGXGP035-82013、CHGXGP035-72013和CHG XLC055-92013共4株毒株在S1功能区的139-140位有2个氨基酸缺失，在140处有1个氨基酸缺失，在163-164位处有氨基酸插入。在S1功能区234-238位处，CHGXLC224-22012株有5个氨基酸插入。

参照经典疫苗株CV777，本研究41毒株在MMR区域共有54个地方发生了氨基酸点突变。392位由K→R、377位由K→D、364位的E→A、362位由V→A、357位由T→A、355位由I→T、323位由F→S、281位由W→L。除了经典参考株CV777株和CHGXGP035-82013、CHGXGP035-72013、CHGXLC055-92013、CHGXLC055-52013共4株毒株外，其余37株毒株在265位氨基酸由L→V、299位由M→I；除了CHGXXA010-32012毒株外，其余40株毒株在第308位都由A→V。CHGXNN028-12013在2C10区的氨基酸有在1个突变。在SS5区第750位氨基酸，CHGXNN026-62013株由I→L。在SS6区的第765位氨基酸，本研究所有毒株由D→S。在S1P1表位区和S1P3表位区的氨基酸突变数分别是8和7(图4)。

图4 S基因部分抗原区域推定的氨基酸序列比较Fig.4 Comparison of deduced amino acid sequences of S genes

3 讨论

本研究毒株进化树图谱结果显示，广西当前流行的PEDV毒株属于2个谱系，Cluster1包括CHGXLC055-52013、CHGXLC055-92013、CHGX GP035-72013和CHGXGP035-82013和参考毒株CV777。Cluster3包括本研究其余37株毒株和韩国株Spk1、HuN和日本株NK等参考毒株。说明广西当前流行的PEDV与CV777、LZC等国内早期毒株存在较大的差异，进化树亲缘关系比较远；与日本株NK、韩国株Spk1、HuN在进化树图谱上亲缘关系比较近。该结果也与郑逢梅等的研究结果类似[13]。说明全国各地PEDV出现了新变种。为了更好防控PEDV的侵袭，研究当前流行的PEDV遗传特征有益于开发合适的疫苗。本研究结果与已有报道结果相似[14]。

S蛋白可分为S1和S2两个功能区，对冠状病毒S1亚基的研究对了解病毒的变异特征有帮助[15]。研究结果表明，广西当前流行的PEDV与经典疫苗株相比存在较大氨基酸缺失、插入和突变，并主要发生在S1功能区。如在59-62位氨基酸处，经典疫苗株CV777等参考毒株都有4个氨基酸缺失；在60位氨基酸处，本研究的有37株毒株与CH-SDQD-2011和CH8等参考毒株存在缺失。在140位处氨基酸处，只有参考经典疫苗株CV777有缺失。SS5和SS6比较保守。广西当前流行的PEDV与中国疫苗株CV777存在比较大变异，提示以经典毒株制备的疫苗在防控PEDV侵蚀时可能无法为猪群提供良好的免疫保护效果。广西当前流行PEDV毒株氨基酸的突变是否会引起生物学功能的改变有待研究。

广西当前流行的PEDV毒株抗原表位区域存在较大变异，与CV777、LZC等国内早期毒株存在差异较大，亲缘关系比较远。提示源自经典毒株CV777的疫苗在防控PEDV入侵时可能不会产生良好的免疫保护效果。