复方非泼罗尼滴剂对犬蜱虫感染的治疗试验

冻杨美，林德贵，晏 磊，周德刚，潘贵珍，田朋飞，杨绒娟

(1.国家兽用药品工程技术研究中心/洛阳惠中兽药有限公司，河南洛阳 471003；2.中国农业大学动物医学院，北京 100083；3.洛阳乐宠健康科技有限公司，河南洛阳 471003)

近年来，随着全球气候变暖和环境变化，蜱及蜱媒病的发生率逐年升高[1]。蜱是专性吸血的外寄生虫，蜱媒病是由蜱虫携带病原后叮咬吸血而传播的疾病，蜱媒病不仅是自然疫源性疾病，也是人畜共患病，如全球范围内广泛流行的莱姆病、巴贝斯虫病、人单核细胞埃里克体病以及欧洲和中东地区的地中海斑点热[2-4]。近年蜱及蜱媒病已引起大家广泛关注[5-7]。2017年发现蜱传播的疾病又新增一种阿龙山病毒[8]，并从86名具有临床症状的患者体内检测到该病毒。中国疾病预防控制中心发表的2018年全国蜱类监测报告显示[9]，犬类感染蜱指数仅次于牛和羊，因此宠物感染蜱情况不容小觑，蜱媒病的防控具有重要的公共卫生意义。

据此，洛阳惠中兽药有限公司研制了一款用于预防和控制犬蜱虫和跳蚤感染的外用滴剂，为非泼罗尼和甲氧普烯的复方制剂，2020年获得二类新兽药证书。复方非泼罗尼滴剂最早由梅里亚有限公司开发，目前国外已有报道复方非泼罗尼滴剂对犬蜱虫的杀灭效果，本研究采用洛阳惠中兽药有限公司提供的复方非泼罗尼滴剂，通过广泛收集南北地区自然感染蜱患犬进行临床效果评价，以期验证国产复方非泼罗尼滴剂的临床使用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 动物的入选标准：经临床检查和实验室诊断确定感染蜱虫的犬，且近6个月未接受过针对蜱虫等外寄生虫的药物治疗；试验犬在试验前感染蜱虫数量≥1只，品种和性别不限，年龄8周龄或以上。试验用动物来源于北京市中国农业大学动物医院、中农大我爱动物医院和海南省小动物保护协会海口市动物医院接诊的临床病例。

1.1.2 试验药物 ①复方非泼罗尼滴剂。规格：1 mL(100 mg非泼罗尼+90 mg甲氧普烯)；包装：0.67 mL/支，1.34 mL/支，2.68 mL/支；洛阳惠中兽药有限公司。②福莱恩增效滴剂。规格：1 mL(100 mg非泼罗尼+90 mg甲氧普烯)；包装：0.67 mL/支，1.34 mL/支，2.68 mL/支；法国梅里亚集团。

1.1.3 主要仪器 生物显微镜(XSZ-N107CCD)，德国Novel公司；3M听诊器(5620)，美国3M公司；四通道正倒数计时器(PS-396)，深圳追日电子科技有限公司；电子台称(TCS-01R)，厦门佰伦斯电子科技有限公司；电子体温计(MC-347)，欧姆龙(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验分组 试验分为A、B两组，A组为试验组(复方非泼罗尼滴剂)，B组为对照药物组(福莱恩增效滴剂)。共收集试验犬120只，其中北京市60只，A组30只，B组30只；海口市60只，A组30只，B组30只，北京市和海口市入选的试验犬随机分到A组和B组。

1.2.2 给药方案 给药前称量动物体重，按照体重范围选择药物规格，拨开犬肩胛骨间的毛发，将滴剂沿脊柱向后滴于皮肤上，自然风干，至完全吸收，给药1次。体重10 kg以下的犬使用0.67 mL；体重10 kg～20 kg的犬使用1.34 mL；体重20 kg～40 kg的犬使用2.68 mL；体重大于40 kg的犬,每增加10 kg，则使用2.68 mL加0.67 mL,依次类推。用药后严格遵医嘱，试验犬不能洗澡，直至试验结束。

1.2.3 试验周期 受试药物和对照药物的试验周期均为35 d，分别在用药当天(0 d)，用药后1 d～7 d(连续观察)、10 d、14 d、21 d、28 d和35 d随访1次，观察相应指标。

1.2.4 临床观察 用药后密切观察试验犬的精神状态、体温、呼吸、心搏等常规指标，记录药物对试验犬造成的不良反应及副作用。

1.2.5 体外寄生虫检查 在用药当天(0 d)，用药后1 d～7 d(连续观察)、10 d、14 d、21 d、28 d和35 d，观察体表蜱虫感染的情况，并记录每只试验犬感染蜱虫数量。具体操作方法：评估过程两人同时操作，把犬从笼子里提出置于检查台上，一人一侧，逆着毛发生长方向梳理，使皮肤裸露，系统全面地检查头部、背部、腹部及四肢，具体包括犬面部、颈部、体侧、腹股沟、四肢等24处部位。对收集的蜱虫进行显微镜形态学鉴定。

1.2.6 临床症状评分标准 在用药当天(0 d)，用药后1 d～7 d(连续观察)、10 d、14 d、21 d、28 d和35 d对病犬皮肤进行检查。记录动物皮肤病灶部位与分布情况，并按照临床局部皮肤检查指标评分标准对皮肤红疹和皮肤瘙痒程度进行分级，评价用药后临床症状的消失和转归情况。分级标准如下。

皮肤红疹程度分为5个等级：无红疹或已退化(0),红疹数1个/4 cm2～5个/4 cm2或面积4 cm2～7 cm2(1),红疹数6个/4 cm2～10个/4 cm2或面积8 cm2～15 cm2(2),红疹数11个/4 cm2～15个/4 cm2或面积16cm2～20 cm2(3),红疹数超过16个/4 cm2或面积超过20 cm2(4)；皮肤瘙痒程度分为5个等级：无(0),偶发1次/10 min～5次/10 min(1),频发6次/10 min～10次/10 min(2),常发11次/10 min～15次/10 min(3),高发>15次/10 min(4)。

1.2.7 药物疗效评价标准 按下列公式分别计算每组动物每种虫体的转阴率、减少率，并计算总的虫体转阴率、减少率，评估各组药效。

虫体转阴率(%)=虫体转阴动物数/试验动物数×100

虫体减少率(%)=驱虫前虫体数-驱虫后虫体数/驱虫前虫体数×100

有效：用药治疗期间和用药结束后，皮肤(或耳部)的体外寄生虫数量平均减少率≥90%，患部无瘙痒，无红疹、皮屑或试验动物自我啃咬的损伤。

无效：用药治疗期间和用药结束后，皮肤(或耳部)的体外寄生虫数量平均减少率<90%，患部仍有瘙痒，红疹、皮屑等，试验动物自我啃咬的损伤明显存在。

2 结果

2.1 临床观察

复方非泼罗尼滴剂组和福莱恩增效滴剂组的试验犬在用药前后试验犬的精神状态、饮水食欲、活动性、体温、呼吸、心搏均无异常，说明试验犬对这两种药物的耐受性均很好。

2.2 体外寄生虫检查

北京市从60只蜱虫感染病例犬身上共收集到83只蜱虫样本，经鉴定79只为血红扇头蜱，4只为长角血蜱。海口市从60只蜱虫感染病例犬身上共收集到72只蜱虫样本，经鉴定均为血红扇头蜱。从表1中可以看出，在南北方不同地区进行治疗蜱虫感染的两组试验犬，在用药后蜱虫数量均得到有效控制，且不同地区、不同组别在用药后各时间点蜱虫数量均无显著差异(P>0.05)，给药后1 d蜱虫数量迅速下降，给药后3 d两个用药组蜱虫数量都下降至零，复方非泼罗尼滴剂组至少可持续维持到第28天。

表1 不同地区蜱虫感染病例用药后蜱虫数量变化Table 1 Changes in the number of ticks in cases of tick infection in different regions after medication

2.3 皮肤临床症状评分数据分析

蜱虫感染病例犬在用药后不同时间点进行临床局部皮肤检查，两组患犬的皮肤病灶主要分布在颈部、腹部，少量分布在背部及四肢，各时间点体表红疹程度、瘙痒程度平均评分结果见表2和表3，用药后两组犬皮肤红疹症状和瘙痒症状均得到明显好转，不同组别、不同地区患犬用药后7 d红疹基本消失，用药后4 d瘙痒症状基本消失，A组和B组之间无显著差异(P>0.05)，可见复方非泼罗尼滴剂可显著缓解、治疗局部瘙痒与红疹症状。

表2 不同地区蜱虫感染病例用药后皮肤红疹程度评分变化Table 2 Changes in skin erythema scores of tick infection cases in different regions after medication

表3 不同地区蜱虫感染病例用药后皮肤瘙痒程度评分变化Table 3 Changes in skin pruritus scores of tick infection cases in different regions after medication

2.4 疗效评价结果

北京市A组患犬综合体表虫体检查结果和局部皮肤检查结果，在用药结束28 d和35 d虫体转阴率分别为100%和83.3%，虫体平均减少率分别为100%和94.8%，第35天有6只患犬复发瘙痒、红疹等症状；B组在用药结束28 d和35 d虫体转阴率分别为96.7%和96.7%，虫体平均减少率分别为99.2%和99.2%，第28天仅有1只患犬复发瘙痒、红疹。

海南市A组患犬综合体表虫体检查结果和局部皮肤检查结果，在用药结束28 d和35 d虫体转阴率分别为100%和100%，虫体平均减少率分别为100%和100%，患部无瘙痒、红疹等症状；B组在用药结束28 d和35 d虫体转阴率分别为100%和96.7%，虫体平均减少率分别为100%和98.9%，第35天仅有1只患犬复发瘙痒、红疹。

根据疗效判定标准，试验药物和对照药物在用药后第28天和第35天，皮肤的体外寄生虫数量平均减少率均>90%，且90%以上患犬无瘙痒，无红疹、皮屑，亦未见试验动物有自我啃咬现象，可见复方非泼罗尼滴剂对治疗犬蜱虫病效果显著。

3 讨论

为科学、公正地评价在田间条件下受试药物对目标适应症的临床治疗效果，本研究根据中华人民共和国农业部公告1425号《宠物用抗体外寄生虫药物药效评价田间试验指导原则》，考察了复方非泼罗尼滴剂对犬蜱虫病的临床治疗效果，旨在评价临床应用的有效性和安全性。

复方非泼罗尼滴剂有效成分为非泼罗尼(10%m/v)和甲氧普烯(9%，m/v)，非泼罗尼作为杀成虫剂作用于蜱和跳蚤成虫，甲氧普烯作为昆虫生长调节剂作用于跳蚤卵和幼虫，二者协同发挥增效作用。复方非泼罗尼滴剂对两种虫体的临床效力验证试验分阶段进行，因此本研究重点回顾性分析了对蜱虫的杀灭作用。非泼罗尼为新型苯基吡唑类杀虫剂，与传统杀虫剂(有机磷类、拟除虫酯类、氨基甲酸酯类)相比，具有广谱、高效、毒副作用小、半衰期长以及对非靶标动物安全的优点[10]，且药物结构新颖、活性高、作用机制独特，属新一代高技术杀虫剂。非泼罗尼为γ-氨基丁酸(GABA-A)受体拮抗剂，参与GABA-A受体周围生物膜活性[11]，通过非竞争性抑制GABA诱导的靶向氯离子通道，导致虫体神经元和肌肉过度兴奋而死亡，可在24 h内杀死宠物体表成年蜱虫、跳蚤。虽然非泼罗尼对昆虫和哺乳动物的作用机制相同，但由于其对昆虫GABA受体的亲和力明显高于哺乳动物，应用时对哺乳动物具有较高的安全性，在本研究期间未见任何不良反应。且文献报道非泼罗尼对昆虫GABA受体的亲和力为哺乳动物的500倍[12]，可见此药安全性高。

蜱虫是危害犬健康的重要外寄生虫，寄生于犬体表的蜱主要有血红扇头蜱、长角血蜱和镰形扇头蜱。本研究从北京市、海口市宠物医院共收集155只蜱虫，经鉴定151只为血红扇头蜱，4只为长角血蜱，表明血红扇头蜱是危害我国犬的主要蜱种，与报道结果一致[13]。我国蜱虫种群分布特点以长角血蜱为主[14]，故应高度重视对血红扇头蜱和长角血蜱的防控。蜱的分布受多种因素影响，温度和湿度是决定蜱发育和存活的关键因素[15-16]，而我国各地气候和地域地理条件的不同，可能会对蜱虫的滋生与繁殖有一定影响，因此验证复方非泼罗尼药效的同时兼顾考察不同地区蜱虫对该药的敏感性，根据指导原则设计在南方(海口市)和北方(北京市)各选择一片区域进行药效评价试验。试验结果表明复方非泼罗尼滴剂对不同地区蜱虫的驱杀效果无明显差异，给药后2 d，患犬体表蜱虫数量迅速下降，用药后3 d即可完全杀灭，且药效可维持28 d，虫体平均减少率可达100%，且试验药物与对照药物无显著差异，与文献[17-18]结果一致。通过临床试验比较沙罗拉纳与非泼罗尼的杀蜱效果，用药30 d内两种药物均可高效杀灭蜱虫，虫体减少率达到94.1%[19]，与本研究在北京市试验结果(虫体减少率94.8%)基本一致。用3种浓度的非泼罗尼(0.025%、0.05%、0.1%，m/v)研究其对蜱虫的杀灭效果，结果证实3种浓度对蜱虫的杀灭率均大于99%[20]。给药42 h后沐浴，反复侵染虫体，杀虫率依然能达到98.52%[21]，且光照、沐浴不会影响其杀虫效果[22]。本研究为更加科学、直观地反映药效，除通过定期检查统计体外寄生虫减少率外，同时借助临床症状指标皮肤瘙痒和皮肤红疹程度评分进行评价，由统计结果可以看出该药药效确切且效力持久。

复方非泼罗尼滴剂对我国南北方蜱虫病均具有较好治疗效果，用药1次可维持28 d，虫体平均减少率可高达100%，按推荐剂量使用有效性强、安全性高，可以用于我国不同地区犬蜱虫病的预防和治疗。临床推荐使用方法：外用，拨开犬肩胛骨间的毛发，将滴剂沿脊柱向后滴于皮肤上，自然风干；体重10 kg以下的犬使用0.67 mL，体重10 kg～20 kg的犬使用1.34 mL，体重20 kg～40 kg的犬使用2.68 mL；体重40 kg以上的犬使用2.68 mL加上体重超出部分对应的剂量，28 d用药1次。