线粒体DNA基因结构损伤与肿瘤关系的研究进展

姚樟燠，刘方舟

[南京医科大学附属肿瘤医院(江苏省肿瘤医院) 头颈外科，江苏 南京 210009]

1 线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)结构与功能特点

线粒体是细菌大小的细胞器，存在于所有有核细胞中，是细胞内ATP的主要生成者[1- 2]。mtDNA是一个多拷贝的16 569 bp的环状双链DNA分子，包含37个基因，其中13个基因编码13个呼吸酶复合体的多肽， 24个基因编码22个转移RNA和2个作用于蛋白质的核糖体RNA(12 s和16 s)。大多数哺乳动物细胞每个细胞含有数百到数千个线粒体，每个线粒体有2～10个mtDNA拷贝[3]。与核基因组相比，mtDNA有其独特的生物学环境和特性:(1) mtDNA是裸露的，缺乏组蛋白的保护，致癌物容易与其结合；(2) 线粒体内脂肪/DNA值高，使亲脂性的致癌物优先在占细胞总DNA量很少的mtDNA上聚集；(3) mtDNA在整个细胞周期中都处于不断合成状态，易受外界干扰，稳定性差；(4) 线粒体内氧的浓度高，易产生氧自由基及过氧化氢等物质，它本身又不能合成谷胱甘肽将其有效清除，故mtDNA易受氧化损伤；(5) mtDNA多聚酶Y的校对功能差，RNA基因部位易形成发夹样结构，导致复制错配频率高；(6) 缺乏有效的基因修复系统，突变mtDNA可在细胞内不停地复制和传播，从而产生数量惊人的重复拷贝[4- 5]。所以mtDNA的突变频率远高于核DNA，并且特别容易受到氧化应激的影响。

2 mtDNA突变与肿瘤关系

线粒体广泛参与细胞活动，包括调节细胞周期、氧化应激和凋亡[6]。1998年，Polyak等[7]做了一个里程碑式的报道，即在人类大肠肿瘤中存在体细胞mtDNA点突变，而在同一个体的健康组织中则不存在。从此，越来越多的研究描述了mtDNA突变在其他几种人类癌症中的高发生率，包括实体瘤和白血病[8- 12]。

D- 环区是线粒体DNA的非编码区。大多数与线粒体DNA复制、转录和翻译相关的调控序列都位于该区域，该区域容易发生突变。Wang等[13]通过基因测序研究喉癌mtDNA D- loop基因突变与临床病理参数的关系，发现喉癌患者mtDNA的D环区域存在大量突变和微卫星不稳定性，表明mtDNA中的D环基因突变可能在喉癌的发生发展中起重要作用。微卫星是人类基因组中的短串联重复序列，微卫星不稳定性是指由于与正常组织相比重复单元的插入或缺失，导致微卫星长度的变化和肿瘤中新微卫星等位基因的出现。Habano等[14]在直肠癌研究中首次提出线粒体微卫星不稳定性。Wang等[13]通过对喉癌病例的研究发现，微卫星不稳定性主要集中在D310区域，表现为poly- C插入增加。在这些情况下，有9个显示插入了一个碱基C，有6个显示插入了两个碱基，在插入两个碱基情况下发现了微卫星内的碱基交换。这与Sanchez- Cespedes等[15]的研究一致，即41%的头颈部鳞状细胞癌在D环区域发生突变。D310区域的HV可能与其在基因的内含子、编码子和启动子中的位置以及复制过程中滑动错误引起的重复修复有关。因此，mtDNA突变的分析，特别是D310区域变化的检测，可能在细胞学诊断中发挥重要作用，特别是对于没有明显形态变化或罕见肿瘤细胞的病例。

mtDNA D- loop有一个特异的突变热点区域，突变程度与胃肠道肿瘤的进展有关。胃肠道肿瘤中mtDNA D- loop突变主要为同质突变，常在嘧啶位点发生突变。线粒体微卫星不稳定性，包括多胞苷延伸的形成，在胃肠道肿瘤中很常见。Wang等[16]证实了中国人胃肠道肿瘤中mtDNA D- loop突变的发生，并支持这些突变与肿瘤进展的相关性，他们发现过度激活的DNA修复功能可能修复胃肠道肿瘤mtDNA损伤，并且与肿瘤的进展表出现出一定的相关性。

Yu 等[17]利用高通量测序策略和建立R0细胞系，在肝癌患者中检测到了新的mtDNA突变，并初步证明线粒体功能障碍可能影响肝癌细胞的增殖和化疗耐药。他们还建立了R0细胞，并鉴定出4个体细胞非同义突变(T6115C，65.74%；G8387A，12.23%；G13121A，93.08%；T14180C，28.22%)可以导致氨基酸替换，tRNA突变可以引起氨基酸替换。通过采用R0细胞构建这些突变杂交体，可以帮助理解这些突变在肝癌进展中的作用。乳腺癌是女性的主要癌症之一，其复杂性和高度异质性的遗传背景是环境因素与核基因组和线粒体DNA突变相互作用的结果。线粒体基因组功能与转化过程相关，肿瘤细胞可以逃避不同的调控机制，但不能逃避能量流动机制。因此，癌细胞可以获得功能性mtDNA突变，作为在适应致癌条件期间调节能量代谢的一种策略[18]。为了评估乳腺肿瘤的体细胞突变格局，并确定mtDNA突变负担是否与乳腺癌的OS相关，Pérez- Amado等[19]对92例墨西哥妇女的外周血液肿瘤样本进行了全mtDNA测序。他们发现24例(26.1%)腺肿瘤的体细胞突变为阴性，68例(73.9%)为阳性，其中78%以上为异质性突变。对乳腺癌和不同类型肿瘤的研究报告了携带mtDNA突变的肿瘤的不同比例(分别为73.7%和45.7%)，由此证明了高频率的异质性mtDNA突变和编码突变(主要是非同义突变)，以及D- 环区和tRNA基因的高突变率。

编码mtDNA突变可以改变蛋白质功能和氧化磷酸化(OXPHOS)系统，而非编码突变可能影响mtDNA复制、转录和结构mtDNA组织等基本生物学过程，从而为肿瘤细胞的增殖提供有利条件[20]。Wallace 等[21]认为，在致癌过程中产生的有害致病突变，当造成蛋白质功能和细胞活力受损时被消除，但如果它们能促进细胞增殖，则被保留下来。

已报道的中枢神经系统肿瘤mtDNA突变的发生率也是由其不同的类型决定的。Mohamed yusoff等[22]研究表明，HVⅡ片段是一个频繁突变的区域，其中11个突变中有9个主要发生在D310序列的保守序列块Ⅱ，一个位于303到315个核苷酸之间的多胞嘧啶单核苷酸重复区域。D310序列的改变，无论是碱基缺失还是插入，是在各种人类癌症中发现的最常见的mtDNA改变，包括脑肿瘤。D310序列是mtDNA复制的重要元件，因为它包含H链复制起始点。因此，D310序列的突变可能通过损害线粒体DNA聚合酶γ和其他反式作用因子的结合来影响线粒体DNA复制的速度。

体细胞mtDNA突变引起的OXPHOS缺陷在人的大肠上皮细胞中随着年龄的增长而增加，Smith等[23]发现OXPHOS功能障碍引起的新陈代谢改变是通过SSP(序列特异性引物)实现的，这种改变为肿瘤的生长提供了一个有利的存活环境。但是mtDNA突变并非肿瘤形成的必要条件，只有线粒体在很重要的功能位点发生突变，并且在一个异质性足够高的水平，这种水平能导致OXPHOS缺陷并能导致有利的新陈代谢改变，才能加速肿瘤的生长。他们认为年龄相关的线粒体OXPHOS缺陷可以通过上调丝氨酸生物合成途径加速肠癌细胞的生长和存活。代谢途径是治疗干预的有吸引力的目标，并且在具有OXPHOS缺陷的肠肿瘤中对SSP的固有依赖可能使它们选择性地容易受到SSP抑制，值得进行研究。

3 mtDNA拷贝数改变与肿瘤关系

mtDNA拷贝数在不同组织间差异很大[24]，但在正常细胞中保持相对稳定[25]。mtDNA拷贝数的异常可能会导致癌症的发生，这取决于多种机制，包括活性氧的产生增加、氧化磷酸化减少、生存蛋白的表达增加以及对凋亡的抵抗[26]。研究人员已经证明，mtDNA拷贝数异常与多种癌症的发生有关，如肺癌、甲状腺乳头状癌、乳腺癌、肝细胞癌、胃癌和卵巢癌等。此外，流行病学研究还探讨了外周血中mtDNA拷贝数的意义，它可以作为预测癌症风险的潜在生物标志物。然而，在不同的癌症中结果是不确定的。例如，较高的mtDNA拷贝数与患肾细胞癌的风险增加有关[27]，但较低的mtDNA拷贝数增加了子宫内膜癌的风险[28]。外周血中mtDNA拷贝数的增加可能是氧化应激和ROS介导的DNA损伤增加的标志，mtDNA拷贝数的增加可能补偿mtDNA的损伤或功能障碍。同时，线粒体增加所产生的ROS可能会对某些细胞内成分造成更多的氧化损伤，进而造成肿瘤的形成与进展[29]。到目前为止，已经有多项研究讨论了mtDNA拷贝数与头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)风险的关系，但现有的结果并不一致。例如，Lin等[30]报道HNSCC患者的mtDNA拷贝数明显更高；但He等[31]报道，与正常组织相比肿瘤组织中mtDNA拷贝数减少。Wang等[32]发现了mtDNA拷贝数和HNSCC风险之间的U型关系，一项嵌套病例对照研究也类似地报道了这一关系，该研究显示，mtDNA拷贝数的最低和最高四分位数与HNSCC风险的增加显著相关。因此，mtDNA拷贝数与某些癌症风险之间的真正关联可能不是简单的线性关系。他们发现mtDNA拷贝数极低和极高均与HNSCC的风险增加显著相关，提示线粒体DNA拷贝数与HNSCC风险之间存在U型关系，为理解mtDNA在HNSCC发病机制中的意义提供了新的视角。

酪氨酸激酶受体(TKR)ERBB2基因拷贝数增加导致癌基因产物过度表达，从而导致细胞增殖失控，并伴有线粒体功能障碍，这在不同的侵袭性肿瘤中都有报道。虽然ERBB2的扩增在不同的研究中都有报道，但mtDNA含量的变化与ERBB2基因拷贝数之间的关系却知之甚少。Ebrahimi等[33]采用实时荧光定量PCR技术检测了70例霍梅尼伊玛目医院收治的乳腺癌患者肿瘤组织中mtDNA的相对含量，结果显示，ERBB2扩增的标本mtDNA含量明显降低。表明ERBB2有可能通过控制mtDNA含量来调节线粒体的活性。研究表明ERBB2和线粒体之间存在串扰。抑制凋亡被认为是HER- 2促进细胞存活的初步功能。ERBB2通过将癌细胞的氧化磷酸化转变为有氧糖酵解作为能量来源，对线粒体的呼吸功能起到调节作用。此外，研究表明ERBB2通过移位到线粒体并调节线粒体呼吸功能而导致心肌细胞线粒体功能障碍。

mtDNA拷贝数的调控是一个受多种因素控制的复杂过程。研究表明，细胞核和线粒体基因组上的不同位点负责维持mtDNA含量。此外，已经证明mtDNA的含量受到许多信号通路激活的影响。已证明通过ERBB2扩增或者过表达激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)对线粒体功能有影响。ERBB2还通过激活特定的HER- 2相关信号通路来控制线粒体功能，促进癌细胞存活和增殖[34]。他们发现ERBB2基因的扩增与mtDNA含量的降低相关。由于ERBB2及其下游信号通路的激活都参与了线粒体生物能量学机制和程序性细胞死亡，因此他们提出了这样的想法，即ERBB2可能通过改变mtDNA含量来调节线粒体的功能，从而介导其作用。

Sun等[35]测定了591例宫颈癌患者和373例正常对照宫颈脱落细胞中mtDNA拷贝数的相对含量，他们发现宫颈癌患者的mtDNA拷贝数中位数明显高于对照组。在调整了年龄和HPV类型后，mtDNA拷贝数水平较高仍然与患宫颈癌的几率增加有关，并且mtDNA拷贝数对宫颈癌存在剂量反应效应。结果表明，mtDNA拷贝数的改变可能与宫颈癌的发生有关，并可能成为HPV阳性妇女分诊的潜在生物标志物。高危HPV感染可能通过加速ROS的产生而导致一系列线粒体功能障碍。mtDNA拷贝数和ROS在宫颈癌发生过程中均升高。虽然HPV感染通常不会引起炎症反应，但病毒致癌基因可以诱导慢性ROS反应。体外研究表明，HPV16 E6蛋白的表达增加了宫颈癌细胞中的ROS水平。HPV16 E6和E7蛋白也可以通过激活NOX2氧化酶引起ROS反应。此外，HPV18E2蛋白已被证明定位于线粒体膜并增加线粒体ROS的产生而不会导致细胞死亡，而低风险的HPV6E2与线粒体的相互作用非常低。ROS的增加被认为会导致mtDNA损伤并启动mtDNA复制，以抵消受损线粒体的功能缺陷。另一种可能性是D- 环区中的特定遗传事件可能导致mtDNA复制的上调。由于正常线粒体在能量产生、代谢和细胞凋亡中起重要作用，mtDNA改变的积累可能在宫颈癌的发病机制中起重要作用[36]。

4 展 望

线粒体是真核生物中仅有的细胞核外含有DNA的细胞器，是OXPHOS产生ROS的主要部位，为细胞活动提供必要的能量和氧自由基。当mtDNA发生突变时，细胞能量供应功能紊乱，产生大量的ROS。这会导致细胞功能的改变甚至坏死，从而表现出各种临床症状。线粒体功能障碍可能在肿瘤发生、早期诊断、耐药、预防复发和预后等方面发挥重要作用。线粒体作为机体细胞内的重要细胞器，参与了能量产生、细胞凋亡、肿瘤的发生以及衰老等多种病理生理的代谢过程。有关mtDNA在肿瘤发生、发展中的作用研究刚刚起步，目前的研究已经能够阐明一些相关的机制：mtDNA突变可能是诱导核基因突变的内源性因素之一，对肿瘤的发生可能有促进作用。但不同部位的实体瘤中mtDNA 的突变和不稳定性不是很一致，对于他们的整体研究还不是很成熟，mtDNA在线粒体间、细胞内及细胞间的调控机制，它们的遗传背景和环境，mtDNA 突变与肿瘤发生和发展的关系等，仍然需要进行深入的研究。总之，线粒体基因结构损伤与肿瘤是一个有潜力的研究领域，将吸引越来越多的科研工作者来开辟生命科学的下一个研究热点。