睡眠剥夺引起血脑屏障损伤机制的研究进展

朱吉祥，黄瑜琳，倪 坤，刘 玥，马正良

南京大学医学院附属鼓楼医院麻醉科，南京 210008

睡眠剥夺是指机体由于生活事件或多种病理生理原因(如药物作用、慢性疾病、精神疾病、睡眠障碍等)而部分或全部丧失正常睡眠量的状态[1]。流行病学资料显示，我国青少年人群中睡眠障碍总体患病率为26%，成年人群中睡眠障碍总体患病率为15%，60岁以上老年人群中睡眠障碍总体患病率为35.9%[2-4]。睡眠剥夺不仅会使注意力稳定性减弱、面孔识别能力降低、工作记忆变差等，还可诱发焦虑、抑郁、行为障碍等[2-5]。因此，睡眠剥夺已成为社会公共卫生问题，严重影响人们的身心健康。

有研究发现，8h完全睡眠剥夺的青年健康志愿者血浆中神经元特异性烯醇化酶和S100钙结合蛋白水平显著增高，而这两个标志物在正常情况下主要存在于神经系统中，其血浆水平的显著增高常提示血脑屏障损伤[6]。另一项临床研究观察到，在健康志愿者经历24 h和40 h的睡眠剥夺后，不仅精神运动性警觉任务评分的中位反应时间显著延长、走神次数显著增加，而且血清中的S100钙结合蛋白水平也显著增加[7]。上述研究结果提示，睡眠剥夺可引起血脑屏障损伤。而多项研究证实，睡眠剥夺是阿尔茨海默病、抑郁症、癫痫等多种神经系统疾病的危险因素，并且血脑屏障损伤是引起或加重这些疾病的关键病理生理基础[4，8-12]。因此，研究睡眠剥夺对血脑屏障的损伤具有重要的临床意义。但目前睡眠剥夺引起血脑屏障损伤的机制尚未完全阐明，本文对近年来研究睡眠剥夺损伤血脑屏障的可能机制予以总结。

睡眠剥夺引起血脑屏障损伤的特点

破坏性和非破坏性损伤共存血脑屏障是血液与脑组织间的一种特殊屏障，主要由内皮细胞、基底膜、周细胞和星形胶质细胞足突等构成，是维护中枢神经系统内环境稳态、保障正常生理功能的重要结构[13]。血脑屏障损伤包括破坏性损伤和非破坏性损伤，前者多伴组织水平的变化，如内皮细胞损伤、紧密连接表达改变、糖萼降解等；而后者多发生在分子水平，表现为主动外排转运体活性增强、细胞内酶活性降低、内吞作用增强等[14]。研究表明，睡眠剥夺不仅增加了大鼠血脑屏障对伊文思蓝的渗透性[15]，也降低了主动外排蛋白对底物罗丹明123的外排[16]，提示睡眠剥夺可同时引起血脑屏障的破坏性和非破坏性损伤。

脑区异质性尽管中枢神经系统血脑屏障的细胞构成一致，但是不同脑区细胞起源、形态、功能存在差异使血脑屏障渗透性也具有异质性[17]。睡眠剥夺引起血脑屏障损伤也具有脑区异质性，主要表现为：(1)损伤程度异质性。Sharma等[15]发现大鼠连续48 h水平台快动眼睡眠剥夺后脑区渗透性改变的程度：小脑皮质>海马>大脑皮层>尾状核>丘脑>下丘脑>脑干；(2)损伤机制异质性。每天20 h连续10 d快动眼睡眠剥夺后大鼠海马、基底核区腺苷A2A受体表达明显增加，而大脑皮质A2A受体表达无明显改变；Hurtado-Alvarado等[18]对睡眠剥夺大鼠腹腔内应用选择性A2A受体拮抗剂后，大鼠海马区与基底核的血脑屏障渗透性得到明显改善，而其他脑区无改善。(3)损伤后恢复速度异质性。研究表明，对每天20 h连续10 d快动眼睡眠剥夺的大鼠恢复自由睡眠2 h后，大部分脑区如扣带回、岛叶皮质、杏仁核、基底核、视前区等血脑屏障渗透性快速恢复，而运动皮层、体感皮层、海马、中脑等脑区血脑屏障渗透性恢复缓慢[19]。

睡眠剥夺损伤血脑屏障的可能机制

外周炎症反应睡眠剥夺可引起全身的炎症状态，而炎症反应与多种病理状态相关，其中包括血脑屏障损伤。有趣的是，Hurtado-Alvarado等[20]对辅助T淋巴细胞(helper T cell，Th)1细胞占优促炎反应为主的C57BL/6小鼠采用每天20 h连续10 d快动眼睡眠剥夺方案后，观察到血浆中炎症因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和海马组织中炎症性指标如离子钙结合衔接分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1)、腺苷A2A受体、金属基质蛋白酶9(matrix metalloprotein，MMP-9)明显升高，海马、大脑皮层、小脑区血脑屏障渗透性明显增加；而Th2细胞占优抗炎反应为主的BALB/c小鼠经过相同的睡眠剥夺方案后，血脑屏障的渗透性无明显改变，同时血浆和海马组织中Iba-1、A2A腺苷受体、MMP-9明显降低，提示睡眠剥夺对血脑屏障的损害与免疫反应相关。Xu等[21]对成年C57BL/6小鼠采用反复间断的快动眼睡眠剥夺(每天20 h连续7 d，3个循环，间隔7 d)方案后，发现睡眠剥夺放大了脂多糖诱发的全身炎症反应和血脑屏障损害，而这种附加作用在实施脾切除术后消失，提示睡眠剥夺诱导的血脑屏障的损伤与持续的外周炎症反应密切相关。体外研究提示，多种炎症因子包括白细胞介素(interleukin，IL)-6，TNF-α，IFN-γ组合在极低剂量条件下即可增加体外血脑屏障模型的渗透性和下调内皮紧密连接蛋白的表达，其可能是激活了核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)[22]。在睡眠剥夺的大鼠皮层微血管提取物中，同样检测到了NF-κB的显著激活和受其调节的MMP-9表达的显著增高[16]。MMP-9既可以水解基底膜，也参与紧密连接蛋白的降解[23]。这些发现提示睡眠剥夺引起血脑屏障的机制与外周炎症微环境密切相关。

此外，Sharma等[15]发现大鼠血浆和大脑皮质表现出睡眠剥夺时间依赖性5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)水平的升高，这种升高伴随着血脑屏障渗透性增加而增加，并且重复应用5-HT3受体拮抗剂昂丹司琼后，血脑屏障的渗透性和神经功能得到改善，提示5-HT3受体及其下游的信号通路在睡眠剥夺诱导的血脑屏障损害中发挥着重要的作用。

中枢炎症反应血脑屏障损伤时外周炎症介质或者免疫细胞可进入中枢，引起中枢星形胶质细胞和小胶质细胞激活，继而参与血脑屏障的功能调节。睡眠剥夺后，多数脑区如皮质、海马、基底核区血脑屏障渗透性增加同时星形胶质细胞和小胶质细胞激活[18]。每天20 h连续7 d快动眼相睡眠剥夺小鼠的海马组织星形胶质细胞α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7-nAChR)的表达明显下调伴认知能力的显著降低[24]。腹腔内应用α7-nAChR激动剂PHA-543613后，海马组织中促炎因子如TNF、MCP-1明显下调，抗炎因子如CD206、TGF-β明显上调并且血脑屏障的渗透性明显改善，与此同时，外周血炎症因子也明显降低，其机制可能是α7-nAChR抑制PI3K/AKT/GSK-3β介导的炎症反应和α7-nAChR介导抗氧化应激作用，进而提高学习和记忆能力[24]。全基因测序差异性分析发现，72 h快动眼相睡眠剥夺小鼠的海马组织中CD44明显上调[25]。过表达星形胶质细胞上CD44增加了体外血脑屏障的渗透性，其机制可能是CD44/NANOG/CDC42调节紧密连接蛋白的表达[25]。小胶质细胞和星形胶质细胞的激活还释放大量与血脑屏障损伤相关促炎因子参与血脑屏障损伤[26]。

星形胶质细胞和小胶质细胞的激活受睡眠剥夺程度的影响。有研究发现，短期睡眠剥夺(6～8 h)仅增加了星形胶质细胞对大突触突触前成分的吞噬，而慢性睡眠剥夺(<5 d)后小胶质细胞出现了吞噬表型[27]。小胶质细胞应激后双相表型转变同样在另一项研究观察到。Haruwaka等[28]研究表明，在炎症早期，血管内皮细胞释放C-C趋化因子配体5(C-C chemokine ligand 5，CCL5)招募血管相关小胶质细胞向血管迁移并与之接触，与此同时小胶质细胞表达claudin-5参与血脑屏障完整性的维持。随着炎症的持续，小胶质细胞的形态发生改变，表现为吞噬表型并释放炎症因子，吞噬星形胶质细胞的足突，增加血脑屏障的渗透性。

周细胞与内皮细胞解偶联生理状态下，脑周细胞沿着内皮细胞表面伸展并包埋在基底膜中。疾病状态下，周细胞可与内皮细胞发生解剖位置的改变和相互作用的受损，从而增加血脑屏障的渗透性[29]。研究者们通过透射电镜观察到大鼠经过每天20 h连续10 d快动眼相睡眠剥夺后，海马区周细胞从与毛细血管壁密切接触状态解离[16，30]，并且通过蛋白组学测定发现介导内皮细胞和周细胞锚定和信号传导的蛋白如可溶性血小板源性生长因子-β和间隙连接蛋白43 表达明显降低[16]。周细胞从与内皮细胞偶联状态中解离可能归因于炎症性微环境或者节律基因的调控[31]。周细胞在血脑屏障中的调节作用得到了越来越多的关注。体外研究提示周细胞诱导内皮屏障紧密性增高和转胞吞作用减弱[32]。脑周细胞的敲减显著增加了血脑屏障对伊文思蓝的渗透性，其可能原因是周细胞以载脂蛋白E亚型依赖的方式调节基底膜的形成[33]。周细胞的敲减对血脑屏障的损伤也具有脑区异质性，皮质、海马、纹状体区的渗透性明显增加，而间脑、中脑、小脑的渗透性无明显变化，这可能与不同脑区周细胞的发育起源有关以及其他机制参与血脑屏障渗透性的调节[34]。

节律基因紊乱睡眠与节律密切相关，而血脑屏障受节律控制基因的调节[35]。急性睡眠剥夺或应激后外周组织DNA启动子甲基化增加，并以组织特异性方式减少节律基因的转录[36-37]。皮层和海马组织中节律基因如脑和肌肉芳香烃受体核转运体样蛋白1(brain and muscle ARNT-like 1，BMAL1)表达振幅在睡眠剥夺后明显降低[38-39]。噪声诱导的睡眠剥夺模型中，主动脉、心脏、肾脏内皮的节律基因转录组呈现出显著改变，节律基因失调与叉头框(fork-head box，Fox)O3下调有关(如BMAL1的启动子区与FoxO3有直接结合位点)；FoxO3激动剂苄普地尔的腹腔给药治疗减轻了睡眠剥夺引起的内皮功能障碍[40]。Qin等[41]发现睡眠剥夺降低了小鼠主动脉内皮细胞节律控制基因隐花色素1(cryptochrome，CRY1)的表达；使用腺病毒过表达CRY1抑制了炎症因子、黏附分子的表达和内皮细胞NF-κB的激活，提示节律基因参与调节了睡眠剥夺诱导的促炎过程。节律基因也影响星形胶质细胞和周细胞的功能活动[42]。敲减BMAL1明显促进了星形胶质细胞激活，并伴随着年龄相关周细胞覆盖率的减少和功能障碍包括血小板源性生长因子-β受体表达下调，从而降低了血脑屏障完整性[43]，这些表现与睡眠剥夺模型大鼠血脑屏障中观察到的一致[16]。因此，节律基因紊乱可能在睡眠剥夺诱导血脑屏障损伤中起着重要的作用。

腺苷/A2A腺苷受体信号激活长时间的清醒和睡眠剥夺增强神经元的活动，使得其能量消耗及细胞外腺苷浓度增加。一项体内微透析研究提示，猫的自发睡眠期相较于清醒期各脑区(基底前脑、大脑皮层、丘脑、下丘脑视前区、中缝背核、被盖核)细胞外腺苷水平下降15%～20%；睡眠剥夺6 h后在上述脑区的基底前脑和大脑皮层检测到腺苷浓度的显著增加[44]。

体外实验提示，给予A2A受体激动剂后血脑屏障渗透性增加，其可能机制是通过adenosine/A2A/cAMP/RhoA/ROCK2信号通路影响F-actin的重组和紧密连接蛋白如血管选择性钙黏素(vascular endothelial-cadeherin，VE-cadherin)、claudin-5、ZO-1(zonula occludens1)等的表达[45-46]。此外，腺苷/A2A腺苷受体信号通路的激活也促进了MMP-9的表达和外排转运蛋白(如P-糖蛋白、乳腺癌耐药蛋白1)泛素化的增加，进而增加血脑屏障的渗透性[47]。Hurtado-Alvarado等[18]对成年大鼠采用每天20 h连续10 d快动眼相睡眠剥夺方案后发现，大鼠海马和基底核区A2A腺苷受体的表达显著增加。经腹腔应用特异性A2A腺苷受体拮抗剂SCH58261后，睡眠剥夺大鼠的多个脑区(皮质、海马、基底核)血脑屏障紧密连接蛋白的表达和屏障渗透性明显恢复，提示腺苷/A2A腺苷受体信号通路在睡眠剥夺引起血脑屏障损伤中发挥着重要的作用[18]。

总结和展望

综上所述，睡眠剥夺已逐渐成为一种日益普遍的社会现象，其引起血脑屏障损伤的机制尚未完全阐明。目前相关研究多为临床前研究且主要集中于皮层、海马等脑区，可能机制主要包括中枢和外周炎症反应、血管神经单元各组分之间的相互作用、节律基因紊乱、腺苷信号激活等。改善患者的睡眠质量，减轻血脑屏障的损伤，或许有助于改善相关神经系统疾病的发生和发展，减缓疾病的进程，从而提高患者的生存质量及长期转归。因此，研究睡眠剥夺引起血脑屏障损伤的机制，不仅需要进一步更加深入的基础研究，还需要更多的临床研究予以支撑和转化，以期为临床诊疗提供更加合理的方案。