复发性流产患者种植窗口期外周血与子宫内膜淋巴细胞亚群比例分析

王耀楷，罗智华，姚吉龙

（1. 广州医科大学2017级硕士研究生，广东 广州 511436；2. 南方医科大学附属深圳市妇幼保健院妇产科，广东 深圳 518000）

复发性流产（Recurrent spontaneous abortions，RSA）是指同一性伴侣发生2次或2次以上的妊娠失败，复发性流产病因复杂，包括遗传、内分泌、解剖，男方异常等。仍有过半数患者找不到明确的病因，这部分患者我们称之为不明原因复发性流产患者［1］。近年来研究表明约半数以上的RSA与免疫功能紊乱有关［2］。母胎免疫耐受是成功妊娠的重要环节，其机制是多方面的，目前应用外周血淋巴评估母胎免疫状态的报道存在争议［3］。子宫内膜作为母胎界面的重要组成部分，当中的淋巴细胞与胎儿来源的滋养细胞直接接触而不产生免疫应答，是胚胎正常发育的免疫基础。因此，我们推测子宫内膜淋巴细胞比例发生改变导致母胎免疫识别紊乱，可能是URSA 的病因之一。本研究采用流式细胞仪对URSA 患者和因男方因素行辅助生殖的妇女的子宫内膜及外周血淋巴细胞亚群比例进行分析，探讨T淋巴细胞亚群及NK 细胞在妊娠维持与胚胎丢失中的作用，以期进一步了解RSA 的发病机制，为临床诊断与防治提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取南方医科大学附属深圳市妇幼保健院复发性流产专科门诊2018 年1 月至2019年1月收治的20例URSA 患者作为观察组。观察组入选标准：同一性伴侣发生两次或两次以上的早期自然流产；既往没有活产、死产及死胎史；平素月经规律，无排卵障碍，基础性激素水平正常；夫妻双方染色体无异常；经超声检查未见生殖系统解剖异常；抗核抗体、抗心磷脂抗体、抗β2 糖蛋白抗体、抗狼疮细胞抗体等自身抗体阴性。观察组排除标准：生殖道支原体、衣原体等感染及TORCH 感染，有生殖道急慢性炎症；近3月有使用甾体类激素等药物。对照组选择明确因男方因素（少、弱、畸精等）行辅助生殖的妇女。观察组平均年龄（30.1±2.6）岁，对照组平均年龄（30.3±2.9）岁，两组患者年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有入选患者均知情同意并签署知情同意书，本研究通过深圳市妇幼保健院伦理委员会审查。

1.2 研究方法

1.2.1 取样时间 两组患者自测尿排卵试纸并进行B 超监测卵泡发育，当检测线出现阳性后行卵泡监测，于排卵后7 d进行外周血及子宫内膜取样。

1.2.2 外周血及子宫内膜取样 晨起空腹抽取外周血2 mL，同日行内膜取样：常规消毒外阴及阴道，置入一次性内膜取样器（宇度，苏州），负压吸取内膜组织约1～2 g，置入生理盐水保存。外周血及子宫内膜组织迅速送至实验室进行淋巴细胞检测。

1.2.3 流式细胞仪检测 流式细胞仪检测外周血及子宫内膜CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T 淋巴细胞、CD3-CD56+CD16+NK 细胞比例。操作步骤按试剂盒（Beckman Coulter，美国）说明进行。

1.3 统计学方法 使用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料数据用±s表示，组间比较应用t检验，外周血与子宫内膜相对应淋巴细胞相关性采用Pearson相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组外周血淋巴细胞比例比较 两组外周血CD3+T 淋巴细胞、CD3+CD4+T 淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞及CD3-CD56+CD16+NK 细胞比例比较差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 两组外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞比例比较/±s

表1 两组外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞比例比较/±s

组别观察组对照组n 20 20 tP CD3+T细胞65.85±9.02 68.02±7.22-0.84 0.41 CD3+CD4+T细胞33.29±7.63 35.98±6.33-1.21 0.23 CD3+CD8+T细胞26.10±6.91 25.62±5.71 0.61 0.81 CD3-CD56+CD16+NK细胞17.71±8.28 16.08±7.45 0.65 0.51

2.2 两组子宫内膜淋巴细胞比例比较 观察组子宫内膜CD3+T 淋巴细胞比例显著高于对照组，CD3-CD56+CD16+NK 细胞比例显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；两组子宫内膜CD3+CD4+T 细胞、CD3+CD8+T 细胞比例比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 两组子宫内膜T淋巴细胞亚群及NK细胞比例比较/±s

表2 两组子宫内膜T淋巴细胞亚群及NK细胞比例比较/±s

组别观察组对照组n 20 20 tP CD3+T细胞61.05±13.22 46.99±9.65 3.84＜0.01 CD3+CD4+T细胞32.17±7.63 33.89±6.53-0.76 0.45 CD3+CD8+T细胞60.32±8.77 61.06±5.00-0.33 0.75 CD3-CD56+CD16+NK细胞30.24±6.61 47.76±7.06-8.11＜0.01

2.3 两组外周血及子宫内膜淋巴细胞相关性分析

两组外周血CD3+T淋巴细胞及CD3-CD56+CD16+NK细胞比例与子宫内膜相对应淋巴细胞亚群比例无相关性（P＞0.05）。

3 讨 论

临床上自然流产的发生率为15%～25%，是临床诊疗的一道难题［2］。随着生殖免疫学研究的发展，发现免疫因素在自然流产过程中起重要作用，约50%～60%的自然流产与妊娠期免疫功能调节紊乱密切相关，既往生殖免疫相关研究表明正常生理妊娠类似于同种异体移植，实际上是母胎半同种免疫耐受结果［4］。

目前，尚无评估母体免疫状态的金标准，既往研究大多通过分析外周血淋巴细胞的比例来评估母体免疫状态及预测妊娠结局［5-6］，但存在争议。最新研究发现，外周血淋巴细胞比例与RSA 发生无相关性，且外周血淋巴细胞比例不能准确反映母胎免疫状态。应用外周血淋巴细胞比例评估母胎免疫状态可能预测妊娠结局不够全面［7］。本研究综合考虑了外周血淋巴细胞及子宫内膜淋巴细胞比例，通过检测URSA 患者外周血淋巴细胞亚群及子宫内膜淋巴细胞亚群比例，探讨RSA 与机体淋巴细胞免疫功能的关系。综合分析了对照组和观察组外周血淋巴细胞亚群及子宫内膜淋巴亚群比例，发现两组外周血淋巴细胞亚群比例无统计学意义，因此，应用外周血淋巴细胞来评估子宫内膜局部免疫状态并不准确。

子宫内膜淋巴细胞主要由T 淋巴细胞及内膜NK 细胞（Uterine natural killer cell，uNK）构成，子宫内膜淋巴细胞比例随月经周期变化［8］，本研究选择促黄体生成素（Luteinzing hormone，LH）峰后7 d 这样一个种植窗口期来模拟受精卵着床时子宫内膜免疫状态，减少月经周期对局部淋巴细胞比例的影响。发现与对照组相比，观察组种植窗口期子宫内膜CD3+T 淋巴细胞比例显著增高，而uNK 细胞比例则显著降低。结果表明，URSA 患者子宫内膜淋巴细胞比例失衡，导致了母胎界面免疫功能紊乱，可能是URSA病因之一。

既往研究表明，T 淋巴细胞亚群平衡在妊娠建立与维持中发挥着重要作用，其亚群失衡导致了RSA 的发生［8-9］。滋养细胞表达一系列独特的主要组织相容性复合体（Major histocompatibility com‐plex，MHC）分子是母胎免疫耐受的基础。人类滋养细胞表达经典的HLA-C 和非经典的HLA-E 来取代高度多态的经典MHCⅠ类分子（HLA-Aand-B）［4］，是胚胎组织对子宫内膜局部T淋巴细胞的免疫逃逸基础。子宫内膜CD3+T 淋巴细胞分为CD4+T 淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞两大亚群，本研究发现，观察组与对照组间子宫内膜CD3+CD4+及CD3+CD8+T 淋巴细胞亚群比例上差异无统计学意义。既往对子宫内膜T 淋巴细胞功能研究发现，子宫内膜局部的T 淋巴细胞可分泌一系列的细胞因子（如：IFN、TNF、IL-6、IL-10 等）调节滋养细胞的功能、诱导母胎免疫耐受及营养胚胎［10-11］。因此，本研究子宫内膜T 淋巴细胞的比例升高，推测可能由于uNK 比例下降引起T淋巴细胞比例相对性升高。

uNK 细胞在子宫内膜淋巴细胞占主导地位，其细胞比例在排卵后开始上升，最高时可占据淋巴细胞中的60%［12］。有学者对早孕期蜕膜NK 细胞的表型及功能分析发现，子宫内膜自然杀伤细胞为一特殊分群的淋巴细胞，且通过微列阵分析证明uNK 细胞与外周血NK 细胞并非同一种细胞［13］，对uNK 细胞比例在生殖免疫方面的作用尚存争议［14-15］。通过对uNK 细胞进行表型分析发现，uNK 细胞以CD3-CD56+为主，并不表达CD16，而CD16 与抗体依赖性细胞毒作用相关［13］。同时，uNK 细胞表面表达抑制性受体如杀伤细胞免疫球蛋白样受体（Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）等，这些抑制性受体分别识别滋养层细胞的HLA-G、HLA-E 和HLA-C 等，两者之间的相互作用导致母体对胎儿不引起免疫应答［16-17］。同样，对uNK 细胞的功能分析表明，uNK 细胞在非孕期子宫内膜期妊娠蜕膜［18］生成一系列的血管生长因子包括血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、胎盘生长因子（Placental growth factor，PlGF）及血管生成素2等［18］，结合uNK 细胞围绕血管分布的特点，推测uNK 细胞通过分泌一系列促血管生成因子促进子宫螺旋动脉的重塑及胎盘的形成。另一方面，电镜显示uNK 细胞胞质内存在膜结合型颗粒，这些颗粒内含穿孔素（Perforin，PFP）和颗粒酶，表明uNK细胞存在溶解细胞的潜能［19］。分析其机制可能是：⑴uNK 细胞比例下降，抑制性受体减少使得uNK 细胞激活性受体和抑制性受体间失去平衡，导致uNK 细胞对胚胎产生溶细胞效应；⑵uNK 细胞比例下降使得其分泌的营养性细胞因子减少，导致滋养细胞侵袭活力下降及胎盘发育不良。

本研究仅仅就外周血及子宫内膜淋巴细胞亚群比例进行分析，如前所述，淋巴细胞数目与功能之间的关系并没有完全明确。因此，仅仅针对淋巴细胞比例而不结合细胞功能来评估子宫内膜局部的免疫状态是不全面的，后续仍需要更多的研究来表明淋巴细胞在子宫内膜局部免疫的角色。