“分心木”水提物对大鼠单侧肾缺血-再灌注损伤的防护作用

张 伟 陈雪洁 刘 蓉 肖朝江 沈 磊 田新雁 姜 北*

1.大理大学药物研究所，云南 大理 671000；2.大理大学基础医学院，云南 大理 671000

肾缺血-再灌注损伤(Renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是指在肾脏缺血的基础上恢复血流后，损伤反而加重的现象，是引发急性肾损伤和肾衰竭的重要因素[1]。RIRI常见于休克复苏、肾脏手术、肾移植等疾患[2]。研究[3-4]认为，缺血-再灌注后自由基大量生成引发的细胞氧化损伤，是RIRI后肾功能受损的重要机制。其中黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XOD)系统是RIRI时自由基增加的重要途径。因此，干预RIRI时XOD的水平，减少自由基的生成是减轻RIRI的有效途径。

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃，为胡桃科(Juglandaceae)胡桃属(JuglansL.)植物。分心木(Diaphragma juglandis fructus,DJF)，药材拉丁名为Xeloseptum juglandis，为核桃果实子房室的木质中隔，是汉族、白族、维吾尔族等多个民族以及民间常用药材。民间主要用于治疗肾虚遗精、遗尿、淋病、血尿、带下、泻痢以及失眠多梦等多种疾病，有健脾补肾的功效[5]；另外《山西中药志》中明确记载：“分心木利尿清热，治淋病尿血，暑热泻痢等症。”现代药理研究[6-7]结果显示，分心木有抑制黄嘌呤氧化酶、抗氧化、抗炎、抑菌等活性。本课题组曾对云南分心木进行了初步的研究，从中分离鉴定了齐墩果酸、柚皮素、儿茶素等近二十个成分，对分心木的化学成分有了初步的认识[7]。鉴于分心木主要用于泌尿系统病症，但目前有关分心木对肾缺血-再灌注损伤是否有保护作用以及作用机制尚不清楚，因此本研究拟通过构建大鼠肾脏缺血-再灌注损伤模型，探讨云南分心木水提物对肾脏缺血-再灌注损伤的防治作用，为深入研究开发利用分心木的药用价值提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠，体重180～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。实验动物生产许可证号SCXK(湘)2019-0004。动物实验完全依照大理大学医学伦理委员会及大理大学药学院实验动物管理委员会的相关规定进行。

1.2 样品和试剂 实验用分心木(DJF)材料2019年购于云南省大理市漾濞县。肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、BCA总蛋白定量测试盒(货号依次为：C011-2-1、CO13-2-1、A002-1-1、A001-3-2、A045-4-2、A003-2-2)购于南京建成生物工程研究所；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)购于上海国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器 酶标仪(赛默飞世科尔科技有限公司)；CO2孵育箱(日本三洋电器公司)；多样品组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司)；BX53F正置显微镜(Olympus公司)；T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；大鼠独立通气笼(苏州市苏杭科技器材有限公司)。

2 方法

2.1 供试样品的制备 取干燥分心木，粉碎后过120目筛，得分心木干粉。取干粉200 g置于蒸馏瓶中，加入500 mL蒸馏水，85 ℃回流提取3次，冷却后过滤，合并滤液，浓缩冻干(每1 g冻干粉折合生药12.5 g)得分心木水提物样品DJF-W。

2.2 建模和分组 40只SD大鼠随机分为4组：对照组、模型组、DJF-W高、低剂量组，每组10只。各组大鼠适应性喂养1周后，进行药物干预。DJF-W冻干粉以蒸馏水溶解，高剂量组和低剂量组分别给予1 g/kg和0.5 g/kg剂量的 DJF-W 灌胃，连续用药14 d，1次/d，灌胃体积为1 mL/100 g，对照组及模型组给予等量的蒸馏水灌胃。末次灌胃后1 h，采用切除大鼠右肾、夹闭左肾肾动脉45 min，再灌注24 h的方法建立RIRI模型[8]。实验动物均于术前禁食12 h，自由饮水。各组动物以0.4 mL/100 g剂量的水合氯醛(10%)腹腔注射，待其充分麻醉后，仰卧位固定于加热鼠板，备皮，消毒，沿腹白线逐层切开，游离右侧肾动脉并永久性结扎，切除右肾并钝性分离左侧肾动脉，将模型组及DJF-W高、低剂量组大鼠的左侧肾动脉用无损伤动脉夹夹闭45 min；对照组不进行夹闭，逐层缝合、关闭腹腔、消毒。术中应用37 ℃生理盐水使大鼠腹腔保持充分的水化。

2.3 取材及生化指标测定 术后24 h，使用负压采血管于大鼠腹主动脉取血，室温静置30 min后，3500 rpm离心15 min，收集上层血清，置于-20 ℃备用，按照试剂盒说明书测定肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活力；取肾组织用4 ℃生理盐水清洗，滤纸吸干后称重，每只大鼠取50 mg左右组织，按1∶9的比例加入0.9%生理盐水，机械匀浆，3500 rpm，4 ℃离心10 min后取上清液得10%的肾脏组织匀浆。按试剂盒说明书测定黄嘌呤氧化酶(XOD)的活性。

2.4 肾组织形态学病变检测 取相同部位肾组织，经生理盐水冲洗后，常规取材，脱水，包埋，制片。肾组织切片H&E染色，在光学显微镜下观察并描述。

2.5 数据处理 数据采用mean±SD在表格表示，SPSS 20.0软件进行统计学分析，进行单因素方差分析(One-Way ANOVE)比较组间差异，P< 0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 RIRI模型构建情况 进行缺血-再灌注处理的肾脏，在该过程中发生的变化如图1，用无损伤动脉夹阻断肾脏血供时，肾脏由鲜红色会逐渐变为紫黑色，45 min后松开动脉夹，5 min内肾脏颜色会逐步恢复。

(从左到右依次为：正常、缺血、再灌注时的肾脏)图1 大鼠肾脏-再灌注时肾脏变化情况图

3.2 各组大鼠血清及肾组织生化指标的比较

3.2.1 肾脏功能指标变化 DJF-W对大鼠血清中Cr和BUN水平的影响情况见表1，与对照组比较，模型组的大鼠血清Cr和BUN水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，DJF-W高剂量可显著降低Cr和BUN的水平(P<0.05)，低剂量样品效果相对较弱，样品效应呈现剂量依赖性。

表1 分心木水提取物对RIRI大鼠模型Cr和BUN水平的影响

3.2.2 氧化应激相关指标变化 分心木水提取物对大鼠血清中SOD与MDA以及肾组织中XOD活力水平的影响情况见表2，与对照组相比较，模型组大鼠血清中MDA及肾组织中XOD的水平明显升高(P<0.01)，且血清中SOD的水平明显降低(P<0.01)；与模型组比较，DJF-W高剂量可显著降低MDA和XOD的水平(P<0.05)，并且可显著提高SOD的水平(P<0.01)，低剂量样品效应最弱，样品效应呈现剂量依赖性。

表2 分心木水提取物对RIRI大鼠模型XOD、SOD和MDA水平的影响

3.2.3 肾组织形态学变化 分心木水提物对大鼠肾脏形态学的影响如图2，将肾组织切片用H&E染色，于200倍数视野下进行图片采集，可以明显看出对照组肾小球和肾小管结构清晰，肾小管边界完整，上皮细胞排列整齐，紧密。与对照组相比，模型组缺血45 min再灌注24 h后的肾脏表现为明显的结构破坏，肾小管上皮细胞可见肿胀坏死，刷状缘脱落，炎症细胞浸润，肾小管严重扩张，肾小管细胞边界不明显，肾小管坏死，肾小球严重损伤。与模型组相比，分心木水提取物有不同程度的减轻RIRI所致的肾损害作用，其中高剂量水提取物的效果最为明显。

A:对照组；B:模型组；C:DJF-W(H)组；D:DJF-W(L)组白色箭头：肾小管结构病变;白色圆圈：炎症细胞浸润；白色方框：肾小球损伤图2 大鼠肾脏病理切片图(×200，标尺：100 μm)

4 讨论

肾脏是高血流灌注器官，良好的血液循环是肾脏组织排除代谢产物和获取养分的基础[9]。哺乳动物体内存在有黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase，XDH)，可通过翻译后修饰转化为XOD[10]，XDH占机体XDH和XOD总活力的90%[11]。肾缺血时，次黄嘌呤和XOD大量堆积[12]，再灌注后，次黄嘌呤在XOD和O2的共同作用下生成大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)[13]。ROS极易与各种细胞结构成分发生反应，干扰氧化应激系统引起细胞氧化损伤[14]，进而导致肾脏结构破坏及功能障碍。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是机体抗氧化酶系统中的关键酶之一[4]，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是自由基介导的脂质过氧化物反应的稳定代谢产物[15]，二者的水平可间接反应机体抗氧化能力和氧化损伤的程度。血清中BUN和Cr是反应肾脏功能的敏感性指标，可间接反应机体肾功能的强弱。

近年来，有关分心木的研究越来越多，结果表明分心木提取物具有较强的抗氧化活性[7,16]；其中的酚酸类和黄酮类化合物均具有良好的体外XOD抑制作用[6]。本文分心木水提物对RIRI的防护作用研究结果显示，与对照组相比，模型组XOD、MDA、Cr和BUN的水平明显上升，SOD的活性明显下降，表明大鼠肾脏缺血-再灌注后，机体出现了氧化损伤，肾脏功能下降；与模型组相比，分心木水提物1 g/kg组的大鼠XOD、MDA、Cr和BUN的水平明显降低，体内SOD活性提高，表明预处理分心木水提物可通过抑制XOD的活性干预ROS的来源，提高机体的抗氧化能力，减轻氧化应激的损伤，改善RIRI后的肾功能，因此对肾缺血-再灌注损伤具有一定程度的防治作用。本研究结果进一步证实了分心木传统上用于肾虚相关性疾病、主要治疗生殖系统与泌尿系统病症的合理性[17]，可为临床前研究提供实验依据，为后续分心木的开发利用提供思路。