清咽六味散的显微和薄层鉴别研究

吴珊珊 李 妍

1.内蒙古自治区国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特 010065；2.内蒙古自治区药品检验研究院，内蒙古 呼和浩特 010010

清咽六味散由丁香、甘草、木香、诃子、玉簪花和石膏等六味药材组成，主要功效为理肺，清咽，蒙医临床多用于治疗外感咳嗽，失音声哑，咽喉肿痛等病症，现收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》，收载项目为制法、性状、检查、功能主治等[1-2]。未见文献对清咽六味散的显微鉴别特征进行研究，已有文献[3-5]报导了清咽六味散中丁香、甘草、木香、诃子的薄层鉴别方法。本课题参照《中国药典》等相关文献对清咽六味散进行了显微鉴别研究，并展开了进一步的薄层鉴别研究，为提高清咽六味散的质量标准，更好地控制其内在质量提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 DM3000 显微镜 (徕卡公司)；LEI-CAMP5 显微镜(徕卡公司)；TLC Visualizer薄层色谱数码成像系统(杭州汉泽科技有限公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Mettler AE-100型电子天平(万分之一，梅特勒-托利多仪器有限公司)；Sartorius ME 5型电子天平(百万分之一，赛多利斯贸易有限公司)；JD200-2型电子天平(千分之一，沈阳龙腾电子仪器有限公司)；DHG-9145A型鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；双槽层析缸(上海信谊仪器厂)。

1.2 材料 丁香酚对照品(批号：110725-201716)、甘草对照药材(批号：120904-201620)、山奈酚对照品(批号：110861-201612)均来自中国食品药品检定研究院；2个厂家3批次清咽六味散样品(批号：151023、140372、140520)；薄层板：预制硅胶G板、预制硅胶GF254板(烟台化学工业研究所；青岛海洋化工厂分厂)，规格：100 mm × 200 mm、200 mm × 200 mm。所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 取本品，置显微镜下观察：花粉粒微黄色，极面观呈三角形(图1A)[6]；木纤维成束，周围薄壁细胞中含草酸钙方晶(图1B)[7]；菊糖多见，表面呈放射状纹理(图1C)[8]；石细胞散在，淡黄色或鲜黄色，呈类长方形、长条形或不规则形，有的略分支或一端稍尖凸，直径18～50 μm，孔沟细密而清晰，不规则分叉(图1D)；花粉粒多破碎，完整者多呈椭圆形，外壁具网状纹理，长径100～150 μm(图1E)；不规则片状结晶无色，有平直纹理(图1F)[9]。

A.丁香花粉粒；B.甘草木纤维成束且周围薄壁细胞含草酸钙方晶；C.木香菊糖；D.诃子石细胞；E.玉簪花花粉粒；F.石膏不规则片状结晶无色图1 清咽六味散显微鉴别特征图

2.2 丁香的薄层色谱鉴别 按清咽六味散处方比例折算，取粉末2 g，加乙醚5 mL，振摇数分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；取除丁香药材外其他五味药材粉末，按处方比例混合均匀，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液；取丁香酚对照品，加乙醚制成每1 mL含16 μL的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2015版通则0502)试验，吸取以上三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰[8,10]。在供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照在相应的位置上无斑点，表明专属性强，如图2。按确定的方法，考察了2个不同厂家的预制薄层板在室温条件下(温度：20 ℃，湿度：29%)的分离情况，结果两种硅胶G板均能达到较好的分离效果；对低温高湿条件下(温度：6 ℃，湿度：58%)的耐用性进行考察，结果显示，该方法对不同温度、不同湿度的耐用性较好，如图3。

1.阴性对照(缺丁香)；2.供试品(批号：151023)；3.模拟处方样品；4.丁香酚对照品图2 清咽六味散丁香TLC图(青岛预制板，温度20 ℃，湿度29%)

1.阴性对照(缺丁香)；2.供试品(批号：151023)；3.模拟处方样品；4.丁香酚对照品；5.供试品(批号：140372)；6.供试品(批号：140520)；A.烟台预制板，温度20 ℃，湿度29%；B.青岛预制板，温度6 ℃，湿度58%图3 不同薄层板和温湿度下清咽六味散中丁香TLC图

2.3 甘草的薄层色谱鉴别 按清咽六味散处方比例折算，取粉末6 g，分别加乙醚40 mL，加热回流1 h，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液[10-11]；将除甘草药材外其他五味药材粉末，按处方比例混合均匀，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液；取甘草对照药材1 g，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015版通则0502)试验，吸取以上三种溶液各2 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视[10]。在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上主要有4个相同的黄色荧光斑点，阴性对照在相应的位置上无斑点，表明专属性强，如图4。按确定的方法，考察了2个不同厂家的预制薄层板在室温条件下(温度：21 ℃、湿度：29%)的分离情况，结果两种硅胶G板均能达到较好的分离效果；对低温高湿条件下(温度：4 ℃，湿度：51%)的耐用性进行考察，结果显示，该方法对不同温度、不同湿度的耐用性较好，如图5。

1.阴性对照(缺甘草)；2.供试品(批号：151023)；3.供试品(批号：140372)；4.甘草对照药材；5.供试品(批号：140520)图4 清咽六味散甘草TLC图(青岛预制板，温度21 ℃，湿度29%)

1.供试品(批号：151023)；2.供试品(批号：140372)；3.供试品(批号：140520)；4.甘草对照药材；A.烟台预制板，温度21 ℃，湿度29%；B.烟台预制板，温度4 ℃，湿度51%图5 不同薄层板和温湿度下清咽六味散中甘草TLC图

2.4 玉簪花的薄层色谱鉴别 按清咽六味散处方比例折算，取粉末8.5 g，加甲醇20 mL，25%盐酸溶液5 mL，水浴加热回流1 h，取出，放冷，滤过，滤液作为供试品溶液；将除玉簪花药材外其他五味药材粉末，按处方比例混合均匀，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液；取山奈酚对照品适量加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2015版通则0502)试验，吸取以上三种溶液各5 μL，分别点于同一GF254薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视[12]。在供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照在相应的位置上无斑点，表明专属性强，如图6。按确定的方法，考察了2个不同厂家的预制薄层板在室温条件下(温度：24 ℃、湿度：30%)的分离情况，结果两种硅胶GF254板均能达到较好的分离效果；对低温高湿条件下(温度：6 ℃，湿度：51%)的耐用性进行考察，结果显示，该方法对不同温度、不同湿度的耐用性较好，如图7。

1.阴性对照(缺玉簪花)；2.供试品(批号：151023)；3.模拟处方样品；4.山奈酚对照品； 图6 清咽六味散玉簪花TLC图(青岛预制板，温度18℃，湿度31%)

1.供试品(批号：151023)；2.供试品(批号：140372)；3.山奈酚对照品；4.供试品(批号：140520)；A.青岛预制板，温度24 ℃，湿度30%；B.烟台预制板，温度24 ℃，湿度30%；C.烟台预制板，温度6 ℃，湿度：51%图7 不同薄层板和温湿度下清咽六味散中玉簪花TLC图

3 讨论

3.1 显微鉴别方法的建立 实验采用显微鉴别方法对清咽六味散处方中六味药材均进行了显微鉴别，结合查阅相关文献，显微镜下均观察到六味药材的专属性显微特征，且清晰可见，可用于清咽六味散的显微鉴别。

3.2 薄层鉴别方法的建立 清咽六味散中丁香为君药，药理活性广泛[2]，有解毒之功效[13]，其中丁香酚为主要活性成分之一，具有抗菌抗病毒等多种作用[14]；甘草具有丰富的化学成分，具有止咳平喘、抗炎抗菌等作用；玉簪花具有清热，解毒，止咳，利咽喉的功能[1]，其中山奈酚为主要活性成分之一，具有并有一定的抗炎、止咳、祛痰作用[15]，故本实验选择处方中丁香、甘草和玉簪花3味药材作为薄层鉴别研究对象，且为首次对处方中玉簪花进行薄层鉴别研究，结果检出了处方中的丁香酚、甘草、山奈酚的斑点，并通过了耐用性考察实验，薄层斑点清晰，阴性无干扰。

清咽六味散作为蒙药复方散剂，具有良好的临床疗效，但迄今为止对其质量标准的定性和定量研究并不多，故本实验建立的显微和薄层鉴别方法对清咽六味散中各味药材真伪和优劣的鉴别以及质量标准的提高均有一定的参考意义。