火疗彝方搽剂的质量标准研究

苏学燕 张英秀 沙学忠 阿俄拉子 张志锋，3*

1.西南民族大学药学院，四川 成都 610225；2.四川省凉山彝族自治州中西医结合医院，四川 西昌 615000；3. 四川省羌彝药用资源保护与利用技术工程实验室，四川 成都 610225

彝药是中国民族医药的重要组成部分，具有上千年临床实践的特点[1]。火疗彝方搽剂收集彝族毕摩经书中记载的药物和彝族常用有效药物组成，是凉山州中西医结合医院彝医医院使用多年的临床经验方，包括曲洛(五加皮)、曲土(没药)、瓦布友(两头毛)、斯赤尼(接骨木)、尔勒斯此(防风)、楚补(木瓜)、布扎(桑百皮)等药材。其中五加皮、没药、防风、木瓜、桑白皮、收载于2020版《中国药典》，两头毛、接骨木收载于2005版《云南省中药材标准》。该搽剂有活血化瘀，止痛的作用，主治风湿病，痛风等。历代医家认为防风有解表散风、祛风止痉等功效，可治疗外感风寒、周身尽痛、风寒湿痹、骨节疼痛等症，尤其是其具有治疗风湿的确切疗效，被大众普遍认可，也是一种具有较大开发价值的中药材资源。而防风中色原酮类化合物是其发挥药效的重要有效成分，升麻素苷是防风色原酮的主要成分[2-5]，因此本实验对该搽剂防风中升麻素苷进行了测定。目前该搽剂没有相关的质量研究，对该产品的使用和推广有一定的制约，因此本实验对火疗彝方搽剂药材五加皮、防风、木瓜、桑白皮、接骨木进行了薄层色谱鉴别，同时对含有的主要指标成分之一升麻素苷作了定性、定量的实验探讨，建立的定性、定量方法简便精确，能有效控制该制剂的内在质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器 WatersUPLCCLASS超高效液相色谱仪(Empower3色谱工作站)；ACQUITYUPLCHSSC18色谱柱(2.1 mm×100 mm Column，1.8μm，Waters公司)；METTLERTOLEPOME55电子天平[梅特斯-托利多仪器(上海)有限公司]；KQ-300DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；HWS-12型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 材料 防风对照药材(批号：20092301)、五加皮对照药材(批号：20052204)、木瓜对照药材(批号：20092301)、桑白皮对照药材(批号：20061302)、升麻素苷对照品(批号：20061302，HPLC>98%)、熊果酸对照品(批号：20080412，HPLC>98%)、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品(批号：20030104，HPLC>98%)、异嗪嚏定对照品(批号：19111305，HPLC>98%)均购自成都康邦生物科技有限公司。接骨木对照药材(批号：200219-054，北京康农兴牧科技发展中心)；屈臣氏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)；色谱级甲醇、乙腈(北京迪科马科技有限公司)；色谱级磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；分析纯盐酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；薄层色谱硅胶G板(批号：20170902，青岛海洋化工厂)，薄层色谱硅胶GF254板(批号：20190916，青岛海洋化工厂)。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITYUPLCHSSC18色谱柱(2.1 mm×100 mm Column，1.8 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脱(0～5 min，15%A；5～12 min，15%～19%A；12～12.5 min，19%～25%A)；检测波长：254 nm；流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：1 μL。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取火疗彝方搽剂处方药材共14.4 g，加入55%的乙醇100 mL，浸泡15 d,用干燥滤器滤过，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 精确称取升麻素苷对照品7.02 mg，用甲醇溶解，制得0.702 mg/mL的标准溶液,作为对照品溶液。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 按处方制备不含防风药材的阴性样品溶液，照“2.1.2”制备成阴性对照样品溶液。

2.1.5 色谱条件与系统的适应性试验 按2.1.1项下条件，取上述升麻素苷溶液、火疗彝方搽剂溶液、阴性对照样品溶液各1 μL，进行测定，同时记录色谱结果。结果显示，火疗彝方搽剂溶液和升麻素苷溶液的保留时间和峰型一致，阴性对照样品溶液色谱图中无干扰峰出现。如图1所示。

A.对照品；B.供试品；C.阴性对照

2.1.6 线性关系考察 分别精密吸取1 mL质量浓度为0.702 mg/mL的对照品贮备液，置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，依次逐级取1 mL定容为0.7020、0.1404、0.0280、0.0056、0.0011 mg/mL的质量浓度，经微孔滤膜滤过，按2.1.1项下条件进样测定，记录峰面积。横坐标为升麻素苷进样浓度(C)、纵坐标为色谱峰峰面积值(Y)，并绘制标准曲线，得到y=12376023x+24720(R2=0.9999)的回归方程。结果显示，升麻素苷在0.0011～0.7020 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.1.7 精密度试验 精密吸取2.1.3项下对照品溶液适量，按2.1.1项下条件连续重复进样6次，并记录峰面积。结果升麻素苷峰面积的RSD为0.19%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0,1,2,4,8,12,24 h时进样测定，记录峰面积。结果升麻素苷峰面积的RSD为0.27%(n=6)，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.1.9 重复性试验 精密吸取样品适量，按照火疗彝方搽剂制备方法平行制备6份供试品溶液，按2.1.1项下条件进样测定。结果升麻素苷峰含量的RSD为1.49%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.1.10 加样回收试验 精密吸取6份已知含量的样品适量，分别精密加入对照品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果见表1。

表1 火疗彝方搽剂加样回收率试验测定结果 (n=6)

2.1.11 样品含量测定 取6批样品，依法制备供试品溶液，按2.1.1项下条件进样测定，记录峰面积，并计算升麻素苷含量。结果如表2。

表2 火疗彝方搽剂升麻素苷含量测定试验结果 (n=6)

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1 溶液的制备 取火疗彝方搽剂20 mL，蒸干，残渣加2 mL甲醇，溶解，作为供试品溶液。另取防风、五加皮、木瓜、桑白皮、接骨木对照药材各1g,分别加入55%乙醇溶液10 mL，浸泡15 d，过滤，蒸干，残渣加2 mL甲醇，作为防风、五加皮、木瓜、桑白皮、接骨木的对照药材溶液。

按照处方组成量，分别去除防风、五加皮、木瓜、桑白皮，精密称取其余药味，浸泡15 d，过滤，蒸干，残渣加甲醇2 mL，分别作为防风、五加皮、木瓜、桑白皮阴性对照溶液；按照处方组成量，去除接骨木、桑白皮、两头毛、防风、精密称取其余药味，浸泡15 d，过滤，蒸干，残渣加甲醇2 mL，作为接骨木阴性对照溶液；

分别称取升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、异嗪嚏定、熊果酸对照品，加10 mL甲醇,分别制成每1 mL含有1 mg的升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、异嗪嚏定、熊果酸的对照品溶液。

2.2.2 试验方法 薄层色谱法按《中国药典》(2020年版)四部通则0502，点样量约10 μL。薄层板：防风，木瓜，桑白皮为硅胶G薄层板 ；五加皮，接骨木为硅胶GF254薄层板。展开剂为防风：三氯甲烷-甲醇(7∶1)；五加皮：三氯甲烷-甲醇(21∶1)；木瓜：环己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(6∶0.5∶1∶0.1)；桑白皮：三氯甲烷-甲醇(9∶1)；接骨木：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(24∶4∶1)。均在紫外光灯(365 nm)下检视。

2.2.3 结果 供试品色谱中，在与防风、五加皮、木瓜、桑白皮、接骨木对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、异嗪嚏定、熊果酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰。结果如图2、图3、图4、图5、图6所示。

1-3.供试品；4.防风对照药材；5.升麻素苷对照品；6.5-O-甲基维斯阿米醇苷对照；7.阴性对照品

1.供试品；2.五加皮对照药材；3.异嗪嚏定对照品；4.阴性对照

1.供试品；2.木瓜对照药材；3.熊果酸对照品；4.阴性对照

1-3.供试品；4.桑白皮对照药材；5.阴性对照品

1-3.供试品；4.接骨木对照药材；5.阴性对照

3 讨论

实验分别考察了超声、加热回流2种提取方法，结果无差异，因此选择操作简便的超声提取法；考察甲醇、乙醇和50%甲醇3种不同提取溶剂[6]及30、45、50、55、60 min 4种不同提取时间，结果甲醇超声45 min时升麻素苷提取率较高，故以甲醇超声45 min为最终提取条件。

采用PDA检测器对升麻素苷成分进行全波长扫描，结果发现于254 nm波长处升麻素苷成分的干扰较小，峰形对称，分离效果好，故选择254 nm作为升麻素苷含量测定的最佳波长。流动相最初选择采用甲醇-水溶液[7]，但其基线不稳，后采用乙腈-0.1%磷酸溶液以(15∶85)，其基线较平稳，信号干扰小，但峰分离效果差，因此采用乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脱(0～5 min，15%A；5～12 min，15%～19%A；12～12.5 min，19%～25%A)，各色谱峰较好的分离，峰形也对称。因此选择乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相。

本研究建立的TLC法专属性强，无干扰；UPLC法测定升麻素苷成分的含量，具有分析速度快、准确性高、重复性好的优点，可用于火疗彝方搽剂中主要防风药材的质量控制，同时为提高火疗彝方搽剂的质量标准提供参考。

火疗技术是收集彝族民间特色技术改进而成，具有良好的温通经脉，散寒除湿作用[8]。其能够利用酒精燃烧时的热力，使药效透过皮肤，刺激体表穴位和病位，通过经络传导，激活脏腑经络功能，调整机体阴阳气血运行(调气)[9-10]。痛风是一种临床上以关节炎和高尿酸血症反复发作为特征的疾病。据相关研究[11-12]痛风的发病率很高。火疗彝方搽剂加工工艺简单使用方便，未发现毒副作用，在凉山州中西医结合医院彝医医院治疗痛风的临床应用超过5年，病例数超5000例，总有效率达91.02%。彝医药是中医学的重要组成部分,而彝药剂型集中体现了彝医几千年来临床用药的特点[13-14]。本研究对火疗彝方搽剂中的主要成分之一升麻素苷进行了定性定量的检测，同时对主药刺五加、防风、木瓜、桑白皮、接骨木进行了薄层鉴别。综上所述，本研究为火疗彝方搽剂质量标准的研究奠定了基础。

随着中药现代化的发展,彝药作为中医药学的重要分支，缺乏科学的研究，而彝药制剂更是面临着前所未有的机遇和挑战。采用现代分析方法从工艺、标准、化学成分等方面去分析彝药制剂，不仅能促进彝药制剂的进一步开发利用，也能为研发历史悠久的彝药制剂提供科学的参考方法。让彝药制剂在最大限度上造福人类。