泽泻对MSG大鼠IL-6、TNF-α含量和基因表达的影响

黄春丽 冯光维 余跃生 邓 莹

黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558013

泽泻为泽泻科植物泽泻Alismaorientale(Sam)Juzep 的干燥块茎，始载于《神农本草经》，列为上品，性寒，味甘，味淡，归膀胱经、肾经，具有利水渗湿泻热、化浊降脂的功效，临床常用于治疗小便不利、水肿涨满、痰饮眩晕、热淋涩痛等病症[1]。现代研究[2-3]发现，泽泻中含有多种化学成分，主要以三萜类和倍半萜类为主，有利尿、降血脂、降血糖、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用。目前对泽泻的研究更多集中在利尿及调血脂方向，近年来也有学者[4-5]研究了对泽泻的抗炎及免疫调节作用，但针对泽泻干预糖尿病相关炎症的研究较少，为此本实验拟通过高糖高脂饮食配合腹腔注射谷氨酸钠复制MSG 肥胖大鼠模型，给予泽泻醇提物治疗后，观察MSG肥胖大鼠血清及肝脏中炎症相关因子表达，为泽泻治疗糖尿病提供更多理论依据。

1 材料与仪器

1.1 动物 SD孕鼠，体重(300～400 g)，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物合格证编号：SCXK(湘 )2014—0011。实验前 1周饲养于黔南民族医学高等专科学校实验动物中心，自由饮食，温度 18～22 ℃。

1.2 药品 泽泻(黔南州鼎鑫生物科技有限公司，批号：180431)；非诺贝特(江苏瑞年前进制药有限公司，批号：1803241)；罗格列酮(成都瑞恒有限公司，批号：190512)。

1.3 试剂与仪器 白介素-6(IL-6)试剂盒(批号：L141118510)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(批号：L141118514)，均由Uscn Life science Inc公司提供。Trizol试剂(Servicebio公司，批号：G3013)；HyPure TMMolecular Biology Grade Water(HyClone公司，批号：SH30538.02)；Servicebio®RT First Strand cDNA Synthesis Kit(Servicebio公司，批号：G3330)；2×SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)(Servicebio公司，批号：G3322)；引物合成(上海生工生物工程股份有限公司合成)；D3024R台式高速冷冻型微量离心机(DragonLab公司)；PC-1000 PCR逆转录仪(PERKIN ELMER公司)；CFX96型Real-Time PCR仪(Bio-Red公司)；SW-CJ-1FD超净工作台(苏净安泰公司)；Epoch酶标检测仪(BioTeK公司)。见表1。

表1 PCR引物序列

2 方法

2.1 泽泻醇提物的制备 先将泽泻药材粉粹成粗粉，取粗粉1 kg加80%乙醇回流提取3次，每次2 h，减压回收溶剂得泽泻醇提取物。

2.2 模型建立及分组 SD大鼠新生乳鼠从第2天开始皮下注射L-谷氨酸钠，剂量为4 g·kg-1·d-1连续注射7 d，正常对照组给予等量生理盐水。MSG组给予高脂饲料喂养，正常对照组普通饲料，8周后眼眶采血检测空腹血糖及血脂变化，以空腹血糖及血脂水平显著高于正常组为造模成功标准。将符合模型标准的48只大鼠，按随机数字表法分为6组，分别为模型组、罗格列酮5 mg/kg组、非洛贝特100 mg/kg组、泽泻4 g生药/kg组、泽泻2 g生药/kg组及泽泻1 g生药/kg组，另取8只空白大鼠作为正常对照组。各组每日灌胃相应药物，连续 8周，给药期间自由进食，饮水。

2.3 标本采集 给药8周后，末次给药前禁食12 h，给药1 h后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，3500 r·min-1，离心15 min，分离血清，分装冻存备用；迅速摘除肝脏、脾脏与胰腺组织剥离周围脂肪组织，称重后液氮冻存。

2.4 指标检测

2.4.1 脏器系数的计算 将剖取的脾脏、胰腺组织，用生理盐水冲洗，滤纸吸干水分后，称重，计算脏器系数。脏器系数=脏器重量(mg)/大鼠体重(g)×100%

2.4.2 血清中IL-6、TNF-α含量检测 采用免疫荧光法检测血清中IL-2，TNF-α含量，具体步骤严格按照试剂盒要求进行。

2.4.3 肝脏组织IL-6 mRNA，TNF-α mRNA的检测 取肝脏研磨后，加入TRIzol按说明提取RNA，按照试剂盒说明书进行反转录，进行PR-PCR实验。

3 结果

3.1 泽泻对MSG大鼠脾脏及胰腺系数的影响 给药8周后，与正常对照组相比，模型对照组脾脏系数显著降低(P<0.01)，胰腺系数显著升高(P<0.01)；与模型对照组相比，罗格利酮组胰腺系数显著降低(P<0.01)，非诺贝特组脾脏系数显著升高(P<0.01)；泽泻高、中剂量组脾脏系数显著升高(P<0.01，P<0.05)，泽泻高、中剂量组胰腺系数显著降低(P<0.01，P<0.05)。泽泻低剂量组对脾脏及胰腺系数没有明显影响。见表2。

表2 泽泻对MSG大鼠脾脏及胰腺系数的影响

3.2 泽泻对MSG大鼠血清中IL-6、TNF-α含量的影响 给药8周后，与正常对照组相比，模型对照组血清IL-6和TNF-α含量显著升高(P<0.01)；与模型对照组相比，罗格利酮、非诺贝特组血清IL-6和TNF-α含量显著降低(P<0.01，P<0.05)；泽泻高、中剂量组肝脏血清IL-6和TNF-α含量显著降低(P<0.01，P<0.05)。泽泻低剂量组对血清IL-6和TNF-α含量没有明显影响。见表3。

表3 泽泻对MSG大鼠血清IL-6和TNF-α含量的影响

3.3 泽泻对MSG大鼠肝脏中IL-6 mRNA，TNF-α mRNA表达的影响 给药8周后，与正常对照组相比，模型对照组肝脏IL-6 mRNA和TNF-αmRNA相对含量显著升高(P<0.01)；与模型对照组相比，罗格利酮、非诺贝特组肝脏IL-6 mRNA和TNF-αmRNA相对含量显著降低(P<0.01，P<0.05)；泽泻高、中剂量组肝脏IL-6 mRNA和TNF-αmRNA相对含量显著降低(P<0.01，P<0.05)；泽泻低剂量组肝脏IL-6 mRNA和TNF-αmRNA相对含量没有明显变化。见表4。

表4 泽泻对MSG大鼠肝脏IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表达的影响

4 讨论

2型糖尿病是一种受环境和遗传因素影响的慢性代谢性疾病，前期患者出现高血糖、高血脂等症状，近年来大量的实验及临床研究[6]发现炎症因子紊乱也是糖尿病特征之一，因此抑制2型糖尿病患者前期体内炎症反应有重要的临床意义。IL-6是一种由脂肪分泌的具有免疫活性的细胞，不仅参与能量代谢与机体炎性反应也密切相关[7]，作为研究糖尿病最突出的炎症因子之一，研究[8]表明IL-6能使胰岛β细胞受损进而引起胰岛素抵抗，最终使血糖水平升高，故IL-6的水平可作为判断糖尿病的重要指标。TNF-α也是一种由脂肪分泌的促炎因子，TNF-α能作用于脂肪及周围组引起胰岛素抵抗，还可以刺激其他炎症因子如IL-6的分泌加重胰岛素抵抗。本实验结果显示采用MSG加高脂饲料复制的MSG肥胖大鼠血清及肝脏中IL-6和TNF-α含量及基因表达都显著升高，经过泽泻醇提物干预后各组大鼠血清中IL-6和TNF-α含量下降，肝脏中IL-6和TNF-αmRNA相对表达下降，说明泽泻具有一定抗炎作用，其作用机制与抑制炎症相关因子IL-6和TNF-α的含量及基因表达密切相关。