参柏湿疹搽剂质量控制方法研究

曾 金 李 萍 欧人豪 肖 萍

广西壮族自治区柳州市妇幼保健院，广西科技大学附属妇产医院 儿童医院，广西 柳州 545001

参柏湿疹搽剂由柳州市妇幼保健院皮肤科用于治疗皮肤湿疹的经验方开发而成。由七味中药组成，包括苦参、黄柏、地榆、紫草、马齿苋、雷公藤、丹参等，具有清热燥湿止痒，凉血活血透疹的功效,临床用于儿童皮肤湿疹具有较好的疗效。方中苦参、黄柏清热燥湿,为主药，苦参中的主要有效成分苦参碱和氧化苦参碱，黄柏中主要有效成分小檗碱、黄柏碱，具有抗菌、抗炎、抗病毒和免疫调节等作用[1-3]。研究通过对黄柏和苦参进行薄层鉴别，同时采用高效液相色谱法对苦参中主要有效成分苦参碱、氧化苦参碱，黄柏中主要有效成分小檗碱和黄柏碱进行含量测定，来达到保证制剂质量和疗效的目的。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪(岛津香港有限公司)；FA1004电子分析天秤(上海天平仪器厂)；HH-6数显恒温水浴锅(江苏金坛市环宇科学仪器厂)；KQ-300DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ZF-1三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司)；DHG-9023AD电热恒温鼓风干燥箱(上海东麓仪器设备有限公司)。

1.2 材料 硅胶板(批号：20181212，青岛海洋化工有限公司)；硅胶预制板G(批号：20130107，国药集团化学试剂有限公司)。苦参对照药材(批号：121019-200705，中国药品生物制品检定所)、黄柏对照药材(批号：121510-201606，中国食品药品检定研究院)；黄柏碱对照品(批号：yz180414)、小檗碱对照品(批号：yz180103)、苦参碱对照品(批号：yz170331)、氧化苦参碱对照品(批号：yz170614)均为南京源植生物科技有限公司；参柏湿疹搽剂(每瓶500 mL)由柳州市妇幼保健院药剂科制剂室提供；乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司) 、甲醇(天津市四友精细化学品有限公司)为色谱纯；其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 苦参薄层鉴别 取本品20 mL，加浓氨试液调pH=9，用三氯甲烷萃取3次(分别为20、15、10 mL)，合并三氯甲烷层，水浴蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取缺苦参的阴性样品，同法制备得苦参阴性对照品溶液。取苦参对照药材2 g，加水200 mL煎煮，滤过，滤液浓缩至20 mL，按样品处理方法制备药材供试品。精密称取苦参碱对照品适量，加甲醇制成0.18 mg·mL-1的对照品溶液。

照薄层色谱法(《中国药典》2015年版一部附录VIB)试验，吸取以上溶液各10 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙酸乙酯-浓氨(2∶3∶4∶0.15)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，日光下检视[1-6]。结果样品与对照品和对照药材在相同位置有橙色斑点，阴性对照无干扰。如图1所示。

注：1.阴性对照；2.对照药材；3.苦参碱对照品；4～6.为供试品

2.1.2 黄柏薄层鉴别 取本品50 mL，加热浓缩至20 mL，加甲醇20 mL，超声处理20 min，过滤，滤液蒸干，甲醇2 mL溶解，离心2 min，取上清液作为供试品溶液。另取缺黄柏的阴性样品，同法制备得黄柏阴性对照溶液。精密称取黄柏对照药材0.1 g，置于锥形瓶中，加甲醇20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液浓缩至2 mL，得黄柏对照药材溶液。精密称取适量黄柏碱、盐酸小檗碱标准品，加甲醇溶解，制成含量分别为0.24 mg·mL-1、0.23 mg·mL-1的黄柏碱对照品溶液和盐酸小檗碱对照品溶液。

按薄层色谱法(《中国药典》2015年版一部附录VIB)试验，吸取以上溶液各10 uL分别点于同一硅胶G板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以稀碘化铋钾试液，日光下检视。结果样品与对照药材和对照品在相同位置有橘色斑点，阴性对照无干扰。如图2所示。

注：1.阴性对照；2、3、4.供试品；5.对照药材；6.黄柏碱对照品；7.小檗碱对照品

2.2 苦参碱和氧化苦参碱含量测定

2.2.1 溶液的制备

2.2.1.1 供试品溶液 精密量取湿疹方样品 5 mL，置于分液漏斗中，加入浓氨试液1 mL，充分振摇后，用30 mL氯仿分3次萃取，每次10 mL，收集氯仿层，置于蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用0.1%磷酸水溶液溶解定容至25 mL，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.1.2 阴性对照 按参柏湿疹搽剂处方工艺制备缺苦参的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成缺苦参的阴性对照溶液。

2.2.1.3 混合对照品溶液 精密称取苦参碱对照品和氧化苦参碱适量，用0.1%磷酸水超声溶解，定容，得到70.4 μg·mL-1苦参碱，19.2 μg·mL-1氧化苦参碱混合对照溶液[7-9]。

2.2.2 色谱条件 Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相为乙腈-甲醇-0.1%磷酸=3∶4∶93，流速1.0 mL/min，柱温30°C，波长220 nm，进样量20 μL。

2.2.3 专属性试验 分别取混合对照品溶液，供试品溶液和阴性对照溶液20 μL按照上述色谱条件进行测定，记录色谱图(如图3所示)。结果表明，供试品溶液中苦参碱和氧化苦参碱色谱峰于相邻色谱峰有效分离，分离度均大于1.5，阴性对照表明无其他杂质干扰。

图3 苦参碱和氧化苦参碱高效液相色谱图

2.2.4 线性关系 精密称取苦参碱对照品 4.4 mg，氧化苦参碱对照品1.2 mg，加适量0.1%磷酸溶液超声溶解，定容至25 mL。分别取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL, 用0.1%磷酸溶液定容至5 mL，得到苦参碱17.6、35.2、70.4、105.6、140.8、176 μg·mL-1和氧化苦参碱4.8、9.6、19.2、28.8、38.4、48 μg·mL-1的混合对照溶液。以0.45 μm的微孔滤膜过滤后按2.2.2色谱条件进样，记录峰面积，以峰面积为Y轴，对照品浓度为X轴，绘制标准曲线，进行线性回归，得到苦参碱回归方程为Y=11608X+38703(R2=0.9995),氧化苦参碱回归方程为Y=12758X+22513(R2=0.9999)，结果表明，苦参碱在17.6～176 μg·mL-1质量浓度范围内，氧化苦参碱在4.8～48 μg·mL-1质量浓度范围内与峰面积成良好的线性关系。

2.2.5 精密度 精密吸取制备好的同一供试品溶液20 μL，按“2.2.2”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱峰面积的RSD分别为0.943%、0.465%(n=6)，表明该色谱条件下方法精密度良好。

2.2.6 稳定性 精密吸取制备好的同一供试品溶液20 μL，按“2.2.2”项下色谱条件，分别在制备样品后 0、2、4、6、8、10、24 h 进样，记录峰面积。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱峰面积的RSD分别为1.23%、1.52%(n=6)，均<3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性 取同一批次参柏湿疹搽剂，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱的平均含量分别为226.19、33.78 μg·mL-1，RSD 分别为 1.41%、1.75%(n=6)，均<3%，表明该方法重复性较好。

2.2.8 加样回收率 取已知含量的参柏湿疹搽剂1.25 mL，混合对照1.25 mL(其中苦参碱：样品含量=1∶1，氧化苦参碱：样品含量=1∶1)，再按“2.2.1(1)”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果显示，苦参碱和氧化苦参碱的平均加样回收率分别为 104.49%、96.30%，RSD 分别为2.76%、2.05%(n=6)，表明该方法准确度较好。结果见表1。

表1 苦参碱和氧化苦参碱加样回收测定结果 (n=6)

2.2.9 样品含量测定 取3个批次(批号20200423，20200522，20200624)参柏湿疹搽剂样品各3瓶(每瓶500 mL)，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品中苦参碱和氧化苦参碱的含量求平均值。结果显示，3个批次样品中苦参碱、氧化苦参碱的平均含量分别为208.44 μg·mL-1、41.04 μg·mL-1，平均总含量为249.48 μg·mL-1。按平均含量的80%设限，初步拟定每瓶制剂中苦参碱、氧化苦参碱总含量不得少于199.6 μg·mL-1。样品中苦参碱、氧化苦参碱含量测定结果见表2。

表2 三批样品中苦参碱和氧化苦参碱含量测定结果 (n=3)

2.3 黄柏碱和小檗碱含量测定

2.3.1 溶液的制备

2.3.1.1 供试品溶液 取样品2.5 mL，加1%盐酸甲醇定容至5 mL，离心，取上清液微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.1.2 阴性对照 按参柏湿疹搽剂处方工艺制备缺黄柏的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成缺黄柏的阴性对照溶液。

2.3.1.3 混合对照品溶液 精密称取黄柏碱对照品和小檗碱适量，用50%(1%盐酸)甲醇水溶解，定容，得到15 μg·mL-1黄柏碱，65 μg.mL-1小檗碱混合对照溶液[10-13]。

2.3.2 色谱条件 Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸(每100 mL含十二烷基磺酸钠0.1 g)(B)，梯度洗脱(见表3)，流速1.0 mL·min-1，柱温30°C，波长284 nm，进样量20 μL。

表3 梯度洗脱程序

2.3.3 专属性试验 分别取混合对照品溶液，供试品溶液和阴性对照溶液20 μL按照上述色谱条件进行测定，记录色谱图(如图4所示)。结果表明，供试品溶液中黄柏碱和小檗碱色谱峰与相邻色谱峰有效分离，分离度均大于1.5，阴性对照表明无其他杂质干扰。

图4 黄柏碱和小檗碱高效液相色谱图

2.3.4 线性关系考察 精密称取黄柏碱对照品2.4 mg，50%(1%盐酸)甲醇水定容至10 mL，得0.24 mg·mL-1黄柏碱溶液。精密量取2.5 mL黄柏碱溶液置于10 mL容量瓶中，再加入精密称定的小檗碱对照品2.6 mg，用50%(1%盐酸)甲醇水定容至刻度，摇匀。分别取0.4、0.8、1.25、2.1、2.5 mL，用50%(1%盐酸)甲醇水溶液定容至5 mL，得到黄柏碱4.8、9.6、15、20.4、25.2、30 μg.mL-1和小檗碱20.8、41.6、65、109.2、130 μg·mL-1的混合对照溶液。以0.45 μm的微孔滤膜过滤后按2.3.2色谱条件进样，记录峰面积，以峰面积为Y轴，对照品浓度为X轴，绘制标准曲线，进行线性回归，得到黄柏碱回归方程为Y=28545X+12888(R2=0.9999)，小檗碱回归方程为Y=51.187X+98.34(R2=0.9995)，结果表明，黄柏碱在4.8～30 μg·mL-1质量浓度范围内，小檗碱在20.8～130 μg·mL-1质量浓度范围内与峰面积成良好的线性关系。

2.3.5 精密度 精密吸取制备好的同一供试品溶液20 μL，按“2.3.2”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，黄柏碱、小檗碱峰面积的RSD分别为0.874%、1.643%(n=6)，表明该色谱条件下方法精密度良好。

2.3.6 稳定性 精密吸取制备好的同一供试品溶液20 μL，按“2.3.2”项下色谱条件，分别在制备样品后 0、2、4、6、8、10、24 h 进样，记录峰面积。结果显示，黄柏碱、小檗碱峰面积的RSD分别为1.15%、1.90%(n=6)，均<3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.7 重复性 取同一批次参柏湿疹搽剂，按2.3.1项下方法制备供试品溶液，平行6份，按2.3.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，黄柏碱、小檗碱的平均含量分别为24.5、84.5 μg·mL-1，RSD 分别为 1.46%、2.16%(n=6)，均<3%，表明该方法具有良好的重复性。

2.3.8 加样回收率 取已知含量的参柏湿疹搽剂1.25 mL，混合对照1.25 mL(其中黄柏碱：样品含量=1∶1，小檗碱：样品含量=1∶1)，再按“2.2.2.1(1)”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按“2.3.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果显示，黄柏碱和小檗碱的平均加样回收率分别为 96.03%、99.87%，RSD 分别为2.35%、1.79%(n=6)，表明该方法准确度较好。结果见表4。

表4 黄柏碱和小檗碱加样回收测定结果 (n=6)

2.3.9 样品含量测定 取3个批次(批号20200423，20200522，20200624)参柏湿疹搽剂样品各3瓶(每瓶500 mL)，按照2.3.1项下方法制备供试品溶液，按2.3.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品中黄柏碱和小檗碱的含量求平均值。结果显示，3个批次样品中黄柏碱、小檗碱的平均含量分别为25.39 μg·mL-1、 84.99 μg·mL-1。按平均含量的80%设限，初步拟定每瓶制剂中黄柏碱含量不得少于20.3 μg·mL-1、小檗碱含量不得少于68.0 μg·mL-1。样品中黄柏碱、小檗碱含量测定结果见表5。

表5 三批样品中黄柏碱和小檗碱含量测定结果 (n=3)

3 讨论

苦参和黄柏是参柏湿疹搽剂方中的君药，所以选择对苦参和黄柏进行定性鉴别和定量检测，以苦参中主要有效成分苦参碱、氧化苦参碱，黄柏中的主要有效成分小檗碱和黄柏碱为检测指标建立了高效液相色谱含量测定方法。考虑中药复方制剂中苦参碱和氧化苦参碱可能在一定条件下相互转化[14]，选择苦参碱和氧化苦参碱的总量为检测指标。

在进行黄柏的薄层鉴别时，样品中的黄柏碱斑点看不到，加大点样量以后看到了，可知是样品中黄柏碱含量较低的缘故。调整样品处理量为50 mL后，可以看到黄柏碱斑点。

进行小檗碱含量测定研究时，发现测得的含量不稳定，考虑其溶解性的缘故，经过尝试甲醇，1%盐酸甲醇，50%甲醇水后，调整样品和对照品的配制溶剂为50%(1%盐酸甲醇)水。经过调整后，峰型较好，含量比较稳定。

综上，研究建立了参柏湿疹搽剂中苦参、黄柏的薄层色谱鉴别方法，鉴别斑点清晰，阴性对照无干扰；建立了搽剂中苦参碱、氧化苦参碱和黄柏碱、小檗碱的高效液相色谱含量测定方法，并初步拟定了苦参碱和氧化苦参碱总含量不少于199.6 μg·mL-1，黄柏碱、小檗碱含量分别不少于20.3 μg·mL-1和68.0 μg·mL-1的质量标准。