高效液相色谱-串联质谱法测定中华绒螯蟹中β-受体激动剂西马特罗残留量

◎ 刘 真，王玉梅

（南京市食品药品监督检验院，江苏 南京 211198）

β-受体激动剂（β-兴奋剂）属于肾上腺类神经兴奋剂，早期用于治疗哮喘，可有效松弛支气管平滑肌，在兽药治疗领域发挥一定作用[1]。由于其作为饲料添加剂应用在羊、肉鸡和猪等的养殖中能够减少动物脂肪的产生，增加肌肉蛋白含量[2-3]，而被错误地应用于动物养殖中，俗称“瘦肉精”，导致一系列因食用含有β-受体激动剂的食物而引起的中毒事件。目前，我国农业农村部公告第250号明确规定β-兴奋剂（β-agonists）及其盐、酯为食用动物中禁止使用的药品[4]。西马特罗（Cimaterol）属于一种新一代的β-受体激动剂，2015年原国家食药监总局发布的65批次食品不合格通告中就有一批猪后臀尖检出禁用药物西马特罗。如果长期食用含有西马特罗的动物源性食品，将会损害身体健康甚至危及生命。

目前，西马特罗的检测方法研究主要集中在猪、牛、羊等畜肉产品上。肖雄枫等利用表面增强拉曼技术快速检测新鲜猪肉中的β-受体激动剂含量（包括西马特罗），检出限为0.005 μg·g-1[5]。张燕等利用酶联免疫分析方法测定了动物源性食品（猪肉、鸡肉及牛肉样品）中西马特罗残留量，检出限为0.09 μg·L-1[6]。张连明等构建了一种DNA辅助识别的西马特罗分子印迹传感器用于猪肉样品中西马特罗的检测，检出限为3.2×10-14mol·L-1[7]。LIU等用新型分子印迹聚合物萃取法结合液相色谱-串联质谱仪对猪肉组织中的β-受体激动剂进行灵敏检测，检出限小于0.02 μg·kg-1[8]，但是针对中华绒螯蟹这一基质类型中西马特罗的检测分析研究较少。本文建立了一种用于针对中华绒螯蟹中β-受体激动剂西马特罗残留量的高效液相色谱-串联质谱法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）检测方法，并利用该方法对市售实际样品进行了风险监测，积累了其西马特罗残留量的数据，为进一步加强中华绒螯蟹安全监管提供了一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与标准品

液相色谱-串联质谱联用仪（Aglient 1290-6470 HPLC-MS/MS）：配有电喷雾离子源（ESI）；pH计（梅特勒-托利多）；涡旋振荡器（Thermo Fisher）；离心机（Thermo Fisher LYNX 4000）；固相萃取柱过柱装置（CNW 24位）；氮吹仪（莱伯泰科 MV5）；振荡水浴锅（金坛精达 SHA-B）；0.22 μm有机系微孔滤膜（上海安谱实验科技有限公司）；滤纸及玻璃漏斗。

0.2 mol·L-1乙酸钠缓冲液：称取13.6 g三水合乙酸钠（分析纯），溶解于500 mL水中，用适量乙酸调节pH值为5.2）。β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶（≥10 000 units/mg）；5%氨水-甲醇溶液：移取50 mL氨水（分析纯）于1 L容量瓶中，用甲醇（色谱级）定容至刻度，混匀）。SCX强阳离子交换柱（月旭科技，500 mg/6 mL。甲醇（色谱级）；0.1 mmol·L-1高氯酸-水溶液（准确移取8.7 μL高氯酸，用水稀释至1 L容量瓶中）；标准品：西马特罗标准品（CAS：54239-37-1）、克伦特罗-D9标准品（CAS：129138-58-5）、沙丁胺醇-D3标准品（CAS：1219798-60-3），均购自天津阿尔塔公司。

1.2 样品提取

1.2.1 提取

称量2 g（精确到0.01 g）均质的中华绒螯蟹样品（仅均质肉及性腺）于50 mL离心管中，加入20 mL 0.2 mol·L-1的乙酸钠缓冲液及20 ng克伦特罗-D9内标溶液（即200 μL 100 ng/mL的克伦特罗-D9内标溶液）后充分涡旋混匀，加入β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶50 μL，于37 ℃下过夜酶解（16 h），酶解液在10 000 r·min-1转速下离心3 min，经滤纸过滤后，定量移取10 mL滤液待净化。

1.2.2 净化

SCX净化柱依次经6 mL 5%氨水-甲醇溶液、6 mL甲醇、6 mL水、6 mL 0.1 mmol·L-1高氯酸-水溶液活化，将上述10 mL待净化滤液上柱净化，依次用2 mL甲醇及2 mL水分别淋洗，并彻底抽干小柱，最后用6 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脱待测物，接收洗脱液，在40 ℃水浴下氮气吹干，定容至1 mL 10%甲醇-水溶液中，涡旋混匀，经0.22 μm有机滤膜过滤后经液相色谱-串联质谱仪上机测定，内标法定量。

1.3 HPLC-MS/MS分析

1.3.1 色谱条件

色 谱 柱：Aglient Exlipse C18色 谱 柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；进样体积：1 μL；流速：0.3 mL·min-1；色谱柱温：40 ℃；流动相：A（0.1%甲酸-水溶液）、B（甲醇）；流动相梯度洗脱程序为0～1 min，95%～75%A；1～2 min，75%～60%A；2～3 min，60%～95%A；3～5 min，95%A。

1.3.2 质谱条件

干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：11 L·min-1；雾化气压力：35 psi；鞘气温度：325 ℃；鞘气流速：11 L·min-1；毛细管电压：4 000 V；电离方式：正模式扫描（ESI+）；监测方式：多反应监测模式（MRM）；监测离子对：西马特罗（219.8/202.0、219.8/159.7、219.8/143.1、219.8/116.1），克伦特罗-D9（286/204.1、286/133.1）。

1.4 数据处理

标准溶液及待测样品溶液通过高效液相色谱-串联质谱仪进行分离测定，以西马特罗及内标克伦特罗-D9的浓度比值作为横坐标，以西马特罗及内标克伦特罗-D9的峰面积比值作为纵坐标绘制西马特罗的定量标准曲线，利用该标准曲线对待测样品溶液中的目标物质进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 定性及定量离子的确定

西马特罗及克伦特罗-D9的结构式如图1所示，西马特罗及克伦特罗-D9的质量数分别为219.28及286.248。利用安捷伦液质联用仪Optimizer软件在ESI正模式条件下对两种物质的离子对进行自动优化，得到表1所示定量离子对及定性离子对，其中西马特罗选取了响应最佳的4对离子对，克伦特罗-D9选取了响应最佳的2对离子对，其中西马特罗选取4对离子对，是为了避免实际样品检测中假阳性的出现，当实际样品中4对离子对均出现，且保留时间及离子丰度比均与相当浓度的标准品出峰情况相符合时，才判定实际样品中西马特罗的阳性检出。西马特罗及克伦特罗-D9的质谱图如图2所示。

图1 西马特罗及克伦特罗-D9结构式图

表1 西马特罗及克伦特罗-D9监测离子对汇总表

图2 西马特罗及克伦特罗-D9质谱图

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取试剂及净化柱的选择

由于β-受体激动剂类物质在动物源性食品中，易与动物体内某些成分，如葡萄糖醛苷酸、硫酸等结合成为非游离态，所以对中华绒螯蟹中西马特罗进行提取时先进行酶解反应，利用β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶将西马特罗释放为游离态，再进行净化测定[9-10]。已有研究表明β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶最佳使用的温度为37 ℃，最佳pH值为5.2，因此本实验参考已有文献于37 ℃下酶解16 h，研究了用乙酸调节pH值为5.2的0.2 mol·L-1乙酸钠-乙酸缓冲液及0.2 mol·L-1乙酸铵-乙酸缓冲液的提取效果，同时考察了两款阳离子交换固相萃取柱（分别为强阳离子交换SCX固相萃取柱及混合型阳离子交换MCX固相萃取柱）的净化效果，结果如图3所示[9,11]。由图3中柱状图可知，同样的加标水平条件下，使用乙酸钠缓冲液及SCX净化柱时提取得到的目标物质响应最佳，且6次独立重复性实验之间平行性最好；图3（a）是经过乙酸钠缓冲液提取后，分别经MCX净化柱及SCX净化柱净化后，1 mL10%甲醇-水溶液复溶后的溶液对比，可见SCX净化后的复溶液为无色，净化效果更好，结合图3（b），本实验选取乙酸钠缓冲液作为提取试剂，选取SCX净化柱进行净化实验。

图3 提取试剂及净化柱效果比对图

此外，本实验对是否使用β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶对加标后的中华绒螯蟹样品进行酶解的检测结果进行了考察，两组实验加标量相同，均在37 ℃下孵育16 h，一组酶解，一组未加酶，上机后测定回收的西马特罗峰面积，如图4所示，酶解后目标物质响应更佳，且6次重复性实验平行性更好。因此，本实验决定在前处理过程中采取酶解方案。

图4 酶解及未酶解条件下的西马特罗峰面积对比图

2.2.2 内标标准品的选择

在β-受体激动剂的检测中，最常使用的两种内标分别是克伦特罗-D9及沙丁胺醇-D3[12]，本实验研究了这两种内标对定量结果的影响。如图5所示，保持两种内标在样品复溶液中的浓度均为10 ng·mL-1，外标加标水平为5.0 μg·kg-1时，内标法定量结果远比外标法要好，均大于80%，比较而言，选择回收率效果更好的克伦特罗-D9作为内标使用。

图5 两种内标定量结果及外标法定量结果比较图（n=6）

2.2.3 洗脱溶剂的选择

由于西马特罗目标物质是在偏酸性环境下与强阳离子交换净化柱结合从而保留在净化柱上，因此选取了碱性有机溶剂进行洗脱收集，本实验研究了不同体积比的氨水-甲醇溶液对目标物质的洗脱效果。氨水-甲醇溶液的比例分别为甲醇、2%氨水-甲醇、5%氨水-甲醇、8%氨水-甲醇、10%氨水-甲醇、20%氨水-甲醇，对比了内标法（内标为克伦特罗-D9）定量方式下（加标浓度为7.968 ng·mL-1）不同洗脱溶剂的中华绒螯蟹中西马特罗回收率情况，重复测定3次，结果如图6所示。用内标法定量时，5%比例下洗脱效果最好，因此本实验决定采用5%氨水-甲醇溶液进行洗脱。

图6 内标法定量情况下不同体积比氨水-甲醇溶液洗脱效果图

2.3 线性方程、测定低限及回收率、精密度

取适量西马特罗（Cimaterol）标准溶液及克伦特罗-D9内标标准溶液配制标准工作曲线，结果表明，西马特罗在0.498 0～199.200 0 ng·mL-1范围内呈现良好的线性关系，见图7，线性方程为y=2.760x+0.530 4，线性相关系数大于0.99，其中内标浓度均为10.00 ng·mL-1，测定低限为0.5 μg·kg-1，测定低限处西马特罗信噪比大于10，满足分析要求。

图7 西马特罗线性标准工作曲线图

根据《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）附录F检测方法的确认要求，对食品中的禁用物质，回收率考察应在方法测定底限、2倍方法测定低限和10倍方法测定低限进行3水平试验[13]。因此，针对农业农村部第250号公告中的禁用物质西马特罗[4]，配制标准工作曲线浓度范围为0.498～9.960 ng·mL-1，线性方程为y=2.786x+0.009 7（R＞0.99），进行了中华绒螯蟹基质中1倍（0.5 μg·kg-1）、2倍（1.0 μg·kg-1）、10倍（5.0 μg·kg-1）方法测定低限上的3水平6平行方法学考察，具体结果见表2。由表2可知，不同加标水平下的中华绒螯蟹基质中西马特罗的回收率范围为87.06%～94.10%，相对标准偏差范围为1.92%～8.03%，表明所构建方法重复性好，回收率佳，可用于中华绒螯蟹中西马特罗残留量的准确定量分析。

表2 中华绒螯蟹基质中西马特罗的平均回收率及相对标准偏差表

2.4 基质效应的影响

高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）具有选择性高、灵敏度高，前处理方法多不需要衍生等优势特点，但是HPLC-MS/MS对大多检测物质而言具有一定的基质效应[14-15]，一般表现为较强的基质抑制效应，强基质效应会导致定量结果的偏离。本文采用文献报道的基质效应计算方法[16]，计算公式为基质效应=(1-Am/A0)×100%，其中A0代表纯溶剂中目标物质的峰面积，Am代表中华绒螯蟹样品基质中同等浓度目标物质的峰面积，如果计算结果的绝对值大于50%，表明存在强基质效应；计算结果为负表明存在基质增强效应；计算结果为正表明存在基质抑制效应[12,17]。本实验考察了中华绒螯蟹样品中西马特罗含量为10.0 μg·kg-1的基质效应，基质效应=(1-9 882/62 635)×100%=84.22%，表明中华绒螯蟹中西马特罗的HPLC-MS/MS检测存在很强的基质抑制效应，定量时需要采用内标法校正曲线或者基质匹配校正曲线修正定量结果，本实验采用克伦特罗-D9内标法定量。

2.5 实际样品的检测

使用本实验中的方法对江苏省内各地湖区和市场随机抽样购买的57批次中华绒螯蟹样品进行分析，发现57批次样品中有3批次中检出西马特罗，检出值质量浓度范围为1.70～2.86 μg·kg-1，阳性检出率为5.26%，表明市场中可能存在中华绒螯蟹养殖过程中西马特罗违规使用的风险，需要引起重视和关注。

3 结语

本文研究了中华绒螯蟹中西马特罗检测的高效液相色谱-串联质谱方法，通过过夜酶解和乙酸钠-乙酸缓冲液提取目标物质，经强阳离子交换净化柱净化，氮吹复溶后上机，内标法定量。通过前处理条件的优化，线性关系、测定低限、回收率、精密度及基质效应的考察，建立了一种中华绒螯蟹中西马特罗准确定量的HPLC-MS/MS方法，方法满足检测检验分析的要求。按照所构建方法对市场上57批次实际样品进行检测，发现3批次阳性风险样品，检出率为5.26%，含量为1.70～2.86 μg·kg-1，表明市售中华绒螯蟹存在西马特罗违规使用的风险，应当引起关注。本方法的建立可用于中华绒螯蟹中β-受体激动剂西马特罗的风险监测和数据积累分析，有利于进行相关的安全性评估。