盐酸雷洛昔芬固体脂质纳米粒的制备与体内药动学研究

张 琪，龚麟凤

武汉市红十字会医院药剂科，武汉 430015

盐酸雷洛昔芬(raloxifene hydrochloride，RLX)是由美国礼来公司开发的第二代选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulators, SERMs)，临床上用于预防和治疗绝经后的骨质疏松症，改善绝经后更年期症状，并有潜在的心血管保护作用[1-2]。然而，RLX属于生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system, BCS)Ⅰ类药物，在水中几乎不溶解(为2 μg·mL-1)，且具有极强的肝脏首过效应，口服生物利用度较低，小于2%[3-4]。为了提高RLX的溶解度，提高其生物利用度，研究人员已将其开发成多种新型给药系统，包括固体分散体[5]、脂质纳米粒[6]、介孔碳纳米颗粒[7]、自乳化释药系统[8]和环糊精包合物[9]等。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLNs)是以生物相容性好的固态天然或合成的类脂为载体，将药物吸附或包裹于脂质中制成的新一代纳米粒给药系统，在提高难溶药物的溶解度和口服生物利用度方面得到广泛关注[10-11]。因此，本研究采用热熔乳化-高压均质法将盐酸雷洛昔芬制备成固体脂质纳米粒，并通过大鼠体内药动学评估药物的生物利用度，为提高盐酸雷洛昔芬的口服生物利用度提供一种有效的解决方案。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HWCL-5型集热式恒温磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；SRH500-45高压均质机(ATS工业系统有限公司)；TD5G台式过滤离心机(长沙湘锐离心机有限公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90纳米粒径电位分析仪(英国Malvern公司)；日立Chromaster高效液相色谱仪(日立高新技术公司)；JEM-2100 Plus型透射电子显微镜(日本电子株式会社)；ZRS-8GS型智能溶出试验仪(天津海益达科技有限公司)；DSC3型差示扫描量热仪(梅特勒-托利多国际有限公司)；L-90K型超速离心机(美国贝克曼公司)。

1.2 试药

盐酸雷洛昔芬原料药(质量分数99.5%，批号ST200817-1，重庆圣华曦药业股份有限公司)；山嵛酸甘油酯(德国巴斯夫公司)；大豆磷脂(上海太伟药业股份有限公司)；泊洛沙姆188(德国巴斯夫公司)；乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；纯化水(实验室自制)。

2 方法与结果

2.1 RLX-SLNs的制备

通过对制备工艺进行预实验考察，采用热熔乳化-高压均质法制备RLX-SLNs[12]。称取盐酸雷洛昔芬100 mg、山嵛酸甘油酯2 000 mg和大豆磷脂200 mg加入装有10 mL乙醇的梨形瓶中，搅拌至固体完全溶解，通过旋转蒸发去除乙醇，并放置在真空干燥箱中过夜，得到无色固体脂质混合物，将固体混合物放置在85 ℃水浴中形成熔融状透明油状溶液，恒温保存，作为油相，备用；称取泊洛沙姆18 850 mg加入装有50 mL纯化水的烧杯中，搅拌溶解，水浴加热至85 ℃，恒温保存，作为水相，备用；在2 500 r·min-1磁力搅拌速度下将油相缓慢滴加到水相中，滴加结束后持续搅拌10 min，形成乳白色乳状液；将该溶液进行高压均质处理，设定均质压力为500 bar，循环均质5次，冰水浴冷却，加水定容至50 mL，即得到外观呈乳白色的RLX-SLNs，4～8 ℃低温保存，备用。

2.2 包封率测定

量取RLX-SLNs 4 mL置于高速离心管中，以15 000 r·min-1离心1.5 h后溶液分层，上层为澄清透明溶液，下层为白色沉淀物，移取上层溶液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加流动相定容，得到待测液(W游离)；另取RLX-SLNs 1.0 mL，置于50 mL量瓶中，加乙腈超声破乳，再加入流动相定容，得到待测液(W总)。取上述2份样品，分别用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[13]检测药物含量。用包封率=[(W总-W游离)/W总]×100%计算RLX-SLNs的包封率。计算得包封率为97.8%±1.6%，说明大部分RLX被包裹或吸附在纳米粒中，游离药物极少。

2.3 粒径分布及Zeta电位测定

取RLX-SLNs 0.1 mL，置于聚苯乙烯样品池中，再加入3 mL纯化水稀释，使用Malvern Zetasizer Nano ZS90纳米粒径电位分析仪测定粒径分布与Zeta电位。仪器参数设置：光源为氦-氖激光器，激光功率为4 mW，波长为633 nm，环境温度为25 ℃。结果见图1。

注：A. RLX-SLNs的粒径分布；B. RLX-SLNs的Zeta电位图。

经测定RLX-SLNs的粒径为(194.5±8.5) nm，粒径较小，有利于被小肠上皮细胞通过内吞作用摄取[14]；RLX-SLNs的多聚分散指数(polydispersity index, PDI)为0.183±0.08，说明纳米粒的粒径分布较窄，粒径大小较为均匀；RLX-SLNs的Zeta电位为(-34.3±1.5) mV，有利于体系稳定[15]。

2.4 透射电镜观察

取少量RLX-SLNs，加入纯化水稀释，用滴管取1滴上述稀释液滴加到碳涂层铜网上，均匀铺展，再滴加1滴质量浓度为5 mg·mL-1的磷钨酸钠溶液，负染10 min，之后用滤纸从液体边缘处吸取多余的水分，并放置在红外灯下干燥，在透射电镜下观察，并拍摄照片，见图2。在透射电镜下可清楚地观察到RLX-SLNs呈球形，表面光滑，大小较为均匀，无聚集，未观察到药物晶体。

图2 RLX-SLNs的透射电镜照片

2.5 差示扫描量热法分析

使用差示扫描量热仪对RLX原料药、脂质熔融物、RLX原料药与脂质的物理混合物以及RLX原料药与脂质形成的熔融物进行热分析。精密称取上述4种样品各5 mg放入铝锅中，密封，固定到样品板上，另将空的铝锅密封后固定到另一个样品板上，作为对照，开通氮气，流速为30 mL·min-1，以10 ℃·min-1的速率加热，温度范围为50～350 ℃。结果见图3。

图3 差示扫描量热图

DSC热分析结果显示，RLX原料药在271.2 ℃处出现吸热峰，该吸热峰为RLX的熔点，固体脂质熔融物的熔点均在80 ℃左右，RLX原料药与脂质的物理混合物中脂质的熔点为80.4 ℃，药物的熔点为271.2 ℃，熔点均未发生变化，而RLX原料药与脂质形成的熔融物只出现了脂质的吸热峰，未检测到RLX的吸热峰，说明RLX以分子状态分散在固体脂质中[16]。

2.6 不同pH稀释稳定性

RLX-SLNs经口服进入胃肠道需经历pH改变和被稀释的过程，其物理性质有可能发生变化，进而影响到药物的吸收，因此用不同pH值介质溶液稀释RLX-SLNs来模拟其在胃肠道环境中的稳定性[17]。取RLX-SLNs 1.0 mL分别经pH 1.2、4.5、6.8、7.4溶液稀释50和200倍，在37 ℃条件下放置6 h，检测其粒径分布。结果见表1。

表1 RLX-SLNs用不同pH值介质溶液稀释稳定性结果

研究表明，RLX-SLNs经不同pH值介质稀释后，在放置过程中均未出现絮凝或沉淀现象，粒径大小基本无变化，具有较强的抗稀释性，可以初步预测RLX-SLNs进入胃肠道后不会因为体液稀释或pH改变而发生絮凝或沉淀。

2.7 体外药物释放

采用反向透析法考察RLX-SLNs在不同pH介质溶液中的体外药物释放情况[18]。取RLX-SLNs 2 mL置于透析袋中，系紧两端，放入100 mL释放介质中，释放介质分别选择pH 1.2盐酸溶液、pH 4.5醋酸盐缓冲液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和pH 7.4磷酸盐缓冲液，介质中均添加了质量浓度为5 mg·mL-1的吐温-80，水浴温度为(37±0.5) ℃，磁力搅拌速度为100 r·min-1，并在设定时间点(0.5、1、2、4、6、8、12、24 h)取3 mL介质溶液，经过滤、稀释，用HPLC法检测药物含量，绘制药物累积释放度-时间曲线。见图4。

由图4可见，RLX-SLNs在4种介质中表现出相似的药物释放速率，均为双相释放模式，即前期药物释放为突释，在初始2 h药物释放量约为35%，这主要是来自于游离的和吸附在固体脂质纳米粒表面RLX的释放；后期表现为缓释，在24 h药物释放量约为85%，主要是来自于固体脂质纳米粒内部药物的释放。

图4 RLX-SLNs在4种不同pH介质溶液中体外释放度-时间曲线

2.8 体内药代动力学

2.8.1血样前处理 取100 μL大鼠血浆样品转移到5 mL离心管中，加入乙酸乙酯2 mL涡旋5 min，使血浆蛋白充分沉淀，以5 000 r·min-1离心10 min，取上清液置于另一只5 mL离心管中，放入真空干燥箱中挥干有机溶剂，残留物用100 μL流动相重新溶解，涡旋振荡2 min。按照如下所述色谱条件检测：色谱柱为ZORBAX SB-C8(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为20 mmol·L-1醋酸铵缓冲液(用醋酸调节至pH=4.5)-乙腈(63∶37)，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为289 nm，柱温为35 ℃。方法学验证结果表明，血浆中RLX的质量浓度在50.0～5 000.0 ng·mL-1范围内的标准曲线为y= 0.018 4x+0.010 2(R2=0.999 6)，方法的定量限为20 ng·mL-1，低(50 ng·mL-1)、中(1 000 ng·mL-1)和高(5 000 ng·mL-1)3个质量浓度的药物提取回收率分别为93.9%、94.1%、93.1%，日间和日内精度RSD值均低于5%，说明该方法的提取回收率高，精密度好，可用于血浆样品的分析。

2.8.2动物实验 取12只雌性Wistar大鼠，体质量为(220±20) g，大鼠禁食12 h，期间只提供饮用水。将大鼠分成A、B组，每组6只，A组大鼠用喂食针口服给予RLX混悬剂，B组大鼠用喂食针口服给予RLX-SLNs，给药剂量均为15 mg·kg-1，在规定的时间点(0.5、1、2、4、6、8、12、24 h)用乙醚麻醉大鼠，使用毛细管通过眼眶后静脉丛穿刺取血，血样以4 000 r·min-1离心10 min，分离血浆，收集上清液(血浆)置于-20 ℃条件下冷冻保存，检测前室温解冻，按照色谱条件进样检测药物含量，使用软件WinNonLin©分析血药质量浓度-时间数据，计算药动学参数。结果见表2、图5。

表2 大鼠口服给予RLX混悬剂和RLX-SLNs后药动学参数的比较

图5 血药质量浓度-时间曲线

3 讨论

本研究制备的RLX-SLNs采用山嵛酸甘油酯作为固体脂质，其熔点约为80 ℃，经DSC检测证实RLX是以分子形态溶解到固体脂质中，这样有利于提高药物的溶解度。另外，由于RLX-SLNs的粒径约为200 nm，粒径极小，故拥有巨大的比表面积，可提高对肠壁的生物黏附性，延长了其在胃肠道中的停留时间。

药动学参数检测结果显示，与大鼠口服RLX悬浮剂相比，大鼠口服RLX-SLNs后的半衰期(t1/2)有所延长，达峰时间(tmax)有一定的滞后，达峰血药质量浓度(Cmax)显著提高(P<0.05)，为RLX悬浮剂的4.7倍，口服生物利用度显著提高(P<0.05)，约提高了5.4倍。一方面，RLX-SLNs的外表面是由亲水性的大豆磷脂和泊洛沙姆188构成，改善了纳米粒的润湿性；另一方面，RLX-SLNs通过肠道中的M细胞和淋巴运输被直接吸收进入体循环，减弱了肝首过效应，促进了药物的口服吸收[19]。