罗米地辛对卵巢癌细胞顺铂耐药及PD-L1表达的影响

吴绍梅，张 立，王 晶，马 涛

无锡市妇幼保健院检验科，无锡 214000

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，具有高复发率和高死亡率的特点。在肿瘤细胞减灭术后应用以顺铂(cis-platinum，DDP)为主的联合化疗是当前最常见的卵巢癌临床治疗方案[1-2]。但卵巢癌患者常出现原发性或获得性的顺铂耐药，严重影响了顺铂联合化疗的效果[3]。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)在调控细胞核组蛋白乙酰化修饰中具有重要作用，许多HDAC抑制剂被发现可以调控肿瘤的增殖、侵袭及多药耐药，具有重要的临床应用价值[4-7]。罗米地辛(Romidepsin，又称FK228)是Class Ⅰ家族HDACs的抑制剂，在临床上已被应用于治疗皮肤T淋巴瘤和外周T淋巴瘤[8-9]。本研究使用顺铂耐药卵巢癌细胞系COC1/DDP，系统研究了罗米地辛对COC1/DDP细胞顺铂敏感性、PD-L1表达水平的影响和可能的调控机制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超净工作台、酶标仪、凝胶电泳仪和凝胶成像仪均购自上海天能科技有限公司；蛋白转印仪(Bio-Rad)、流式细胞仪(BD)、荧光定量PCR仪均购自美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 试药

人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP(中国医学科学院细胞库)；Romidepsin(德国Merck公司)；CCK-8细胞增殖试剂盒(日本同仁化学所)；Annexin V/PI细胞凋亡试剂盒(invitrogen)；DMEM培养基、胎牛血清(hyclone)、荧光素偶联PD-L1抗体(FITC-anti-PD-L1 antibody)均购自北京义翘神州科技股份有限公司；总RNA提取试剂盒、SYBRgreen qPCR Mix均购自北京天根生物公司；细胞核蛋白提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；抗组蛋白H3抗体(anti-histone H3)、抗乙酰化组蛋白H3抗体(anti-acetylated H3)、HRP-anti-mouse IgG均购自美国CST公司。

2 方法

2.1 细胞培养

将COC1/DDP细胞株接种在含有青霉素/链霉素和体积分数10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，每2～3 d进行传代。

2.2 CCK-8法检测细胞存活率

将处于对数生长期的COC1/DDP细胞消化、离心并进行细胞计数，调整细胞密度至2×105个·mL-1，接种于96孔细胞培养板，每孔200 μL，让细胞充分贴壁生长。细胞贴壁生长24 h后，将细胞分为2组，Romidepsin组加入终浓度为5 nmol·L-1的Romidepsin，Control组加入等体积的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。各组细胞均分别加入质量浓度梯度为0、2.5、5、10、20、40、80 μg·mL-1的DDP，随后放置于细胞培养箱中贴壁培养24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，最后用酶标仪检测各孔450 nm波长处的吸光度(A)，并计算细胞活力。细胞活力(%)=(A-A空白)/(A0-A空白)×100%。

2.3 细胞凋亡率检测

将处于对数生长期的COC1/DDP细胞接种于6孔细胞培养板，并分为4组：Control组加等体积的DMSO，Romidepsin组加入终浓度为5 nmol·L-1的Romidepsin，DDP组加入终质量浓度为20 μg·mL-1的DDP，Romidepsin+DDP组同时加Romidepsin和DDP。加药培养24 h后，消化、离心收集细胞，用500 μL Annexin V结合缓冲液重悬，并加入10 μL FITC-Annexin V，室温避光孵育15 min后，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，随后用流式细胞仪检测凋亡细胞。

2.4 实时荧光PCR

Control组细胞和Romidepsin组细胞培养24 h后，离心收集细胞，使用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，取1 μg总RNA，使用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA。随后用SYRB green qPCR mix进行实时荧光PCR，分别检测PD-L1和STAT3 mRNA的表达水平，以GAPDH作为内参。

2.5 流式细胞染色检测PD-L1表达

贴壁生长的Control组和Romidepsin组COC1/DDP细胞经过胰酶消化、离心收集细胞，调整细胞密度为2×106个·mL-1。取50 μL细胞悬液，加入0.5 μL FITC-anti-PD-L1抗体，4 ℃避光孵育1 h，随后加入450 μL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)，用流式细胞仪检测PD-L1的表达水平。

2.6 Western blot检测组蛋白乙酰化水平

离心收集各组细胞，使用细胞核蛋白提取试剂盒分离细胞核蛋白，加入5×SDS上样缓冲液，置于100 ℃沸水浴中加热10 min。使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品，随后使用蛋白转印仪将凝胶上的蛋白样品转印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上。PVDF膜经过体积分数5%脱脂奶粉室温封闭40 min后，分别用抗组蛋白H3抗体、抗乙酰化组蛋白H3抗体孵育和HRP二抗孵育，用化学发光(electrochemiluminescence，ECL)底物检测蛋白条带。

2.7 统计学方法

采用Graphpad Prism 7.0软件对数据进行统计学分析，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞存活率

与Control组相比，使用5 nmol·L-1Romidepsin处理的COC1/DDP细胞在各质量浓度梯度(2.5、5、10、20、40、80 μg·mL-1)顺铂处理下，细胞存活率均显著下降(P<0.05)，结果见图1。计算顺铂IC50值，Control组细胞IC50值为24.8 μg·mL-1，Romidepsin组细胞IC50值为10.3 μg·mL-1，逆转指数为2.43。

图1 细胞存活曲线

3.2 细胞凋亡率

与Control组相比，Romidepsin组COC1/DDP细胞早期凋亡率和晚期凋亡率稍微升高，但差异无统计学意义(P=0.058、P=0.103)，而DDP组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均升高(P=0.009、P=0.011)。与DDP组相比，Romidepsin+DDP组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均显著升高(P=0.004、P=0.003)。结果见表1。

表1 各组细胞的凋亡率

3.3 实时荧光PCR实验检测PD-L1 mRNA的表达水平

与Control组相比，Romidepsin组COC1/DDP细胞PD-L1 mRNA的表达水平上升了(2.43±0.57)倍(P=0.012 7)，表明Romidepsin可以促进COC1/DDP细胞PD-L1 mRNA的表达，结果见图2A。

3.4 流式细胞染色检测细胞表面PD-L1表达水平

与Control组相比，Romidepsin组COC1/DDP细胞表面PD-L1信号明显增强，细胞峰值右移，表明Romidepsin处理可以促进细胞PD-L1蛋白在细胞膜上的表达，结果见图2B。

3.5 组蛋白乙酰化水平

Control组与Romidepin组细胞组蛋白H3(histone H3)表达水平无明显变化，但Romidepin组细胞乙酰化组蛋白H3(acetylated H3)水平显著上升，计算条带灰度值，与Control组相比，Romidepin组细胞组蛋白H3乙酰化水平升高了(32.7±8.95)倍(P<0.000 1)，表明Romidepin可以促进组蛋白H3的乙酰化。结果见图3。

注：A.Western blot检测结果；B.灰度值分析。

3.6 荧光定量PCR检测STAT3表达水平

与Control组相比，Romidepsin组COC1/DDP细胞转录因子STAT3的相对表达水平显著下降(1.00±0.09vs.0.69±0.13，P=0.027 4)。

4 讨论

本研究发现HDAC抑制剂Romidepsin可以在体外培养条件下，增强顺铂耐药的卵巢癌细胞COC1/DDP对顺铂的敏感性，顺铂联合Romidepsin处理显著促进了卵巢癌细胞的凋亡。抗血管新生药物治疗、顺铂联合化疗等卵巢癌术后的常用化疗方案，由于许多卵巢癌患者存在多药耐药性，导致化疗效果并不理想[2, 9-11]。因此，探究卵巢癌细胞顺铂耐药的机制、寻找新的联合化疗药物、增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性是解决该问题的主要手段。

Romidepsin是重要的HDAC抑制剂，主要抑制Class Ⅰ家族HDAC(包括HDAC1、HDAC2和HDAC3)的去乙酰化活性，促进组蛋白乙酰化水平的升高[12-13]。在本研究中，用Western blot验证了Romidepsin对COC1/DDP细胞组蛋白H3乙酰化水平的促进作用。在临床上，Romidepsin已经被应用于治疗T细胞淋巴瘤[9]。当前，越来越多的研究表明，Romidepsin对于多种实体肿瘤也表现出显著的抗肿瘤活性。陈柯宇等[14]发现Romidepsin与阿糖胞苷联合用药可以通过增强CASP3启动子的转录活性抑制肺腺癌细胞的增殖和侵袭；PATTARAWAT P等[15]的研究发现Gemcitabine(吉西他滨)、Romidepsin和顺铂联合用药可以显著抑制三阴性乳腺癌的疾病进展。本研究也发现Romidepsin和顺铂联合用药可以显著抑制体外培养的卵巢癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。这一发现提示Romidepsin在卵巢癌临床治疗中的潜在应用价值。此外，本研究还发现经Romidepsin处理的COC1/DDP细胞PD-L1的表达水平也显著升高。PD-L1常高表达于肿瘤细胞，可以通过与杀伤性T细胞表面PD-1蛋白的结合帮助肿瘤逃避免疫系统的杀伤作用[16-18]。Romidepsin处理导致的卵巢癌细胞高表达PD-L1可能会引起免疫抑制，从而促进肿瘤的免疫逃逸。但从另一方面考虑，高表达的PD-L1可能会促进靶向PD-L1的单抗药物的作用。

STAT3是促进细胞增殖、迁移的重要转录因子，一些研究也发现STAT3的高表达和活化与肿瘤细胞的多药耐药性密切相关[19-20]。本研究通过实时荧光PCR实验检测发现经Romidpesin处理的卵巢癌细胞STAT3的表达水平也显著升高，表明Romidepsin可能通过对组蛋白去乙酰化酶的抑制降低了STAT3的转录和表达水平，从而进一步逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。

综上所述，本研究发现了Romidepsin联合顺铂用药可以逆转对顺铂耐药的卵巢癌细胞的耐药性，促进细胞凋亡，揭示了Romidepsin在卵巢癌术后化疗中潜在的重要作用。然而Romidepsin可以促进卵巢癌细胞PD-L1的表达，提示其可能会引起肿瘤的免疫抑制，促进肿瘤免疫逃逸。