吴茱萸碱对结直肠癌小鼠IL-6R/STAT3通路的影响

张 超，荣爱梅，张 磊，王 丹

郑州大学附属郑州市中心医院消化内科，郑州 450000

结直肠癌为临床常见的消化系统恶性肿瘤[1]。近年来，中医学对结直肠癌的研究日益深入，发现从中药中提取的有较强抗肿瘤活性的天然产物是研发抗癌药物的重要来源[2]。吴茱萸是芸香科植物吴茱萸的干燥近成熟果实，性温热，味苦辛，有小毒，有散寒止痛、助阳止泻之功效，含有多种生物碱，吴茱萸碱为其主要活性物质[3]。吴茱萸碱的抗肿瘤活性较强，可抑制多药耐药细胞株的活性等[4-5]。因此，本研究通过建立结直肠癌小鼠模型，考察吴茱萸碱对结直肠癌的抑瘤作用及可能机制，为探索结直肠癌的新药物疗法奠定理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1150H型莱卡石蜡包埋机、PM2245 型莱卡手动轮转切片机、倒置显微镜(德国Leica公司)；ALc系列电子天平(德国Sartorious公司)；1510 Multiscan GO 全波长酶标仪、Micro17 微型离心机均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；CS101-3型电热鼓风干燥箱(上海申光仪器仪表有限公司)。

1.2 试药

顺铂(批号09112983，美国Sigma公司)；吴茱萸碱(质量分数>98%，重庆赛普那斯科技有限公司)；RPMI 1640全培养基(上海安博广利生物科技有限公司)；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin，IL-6)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)酶联免疫吸附测定试剂盒(上海美轩生物科技有限公司)；HE组织染色试剂盒(南昌雨露化学试剂有限公司)；浓缩型兔抗小鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗体(美国Conning公司)；即用型小鼠抗人CD34单克隆抗体、酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物均购自北京中杉金桥生物科技有限公司；S-P超敏试剂盒、即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒、微血管染色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；BCA蛋白浓度定量试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；兔抗小鼠IL-6R、信号转导转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)，磷酸化STAT3(p-STAT3)，G1/S-特异性周期蛋白-D1(G1/S specific cyclin D1，Cyclin D1)，survivin，β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗，均购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.3 实验动物

BALA/C小鼠59只，雌雄各半，6～8周龄，体质量(21±2)g，购自广州中医药大学实验动物中心[SCXK(粤)2013-0034]。实验前适应性喂养1周。饲养条件：标准饲料、自然光照、55%湿度、室温。

1.4 细胞株

CT-26结直肠癌细胞株(美国ATCC公司，保存于液氮中)。

2 方法

2.1 造模与分组

59只小鼠留取9只作为对照组，其余建立结直肠癌小鼠模型[6]：复苏CT-26结直肠癌细胞株，采用含体积分数10%标准小牛血清的RPMI 1640全培养基常规传代培养，在细胞计数为2×106个·mL-1的密度下，取处于对数生长期的细胞，按0.2 mL剂量接种于小鼠右前肢皮下，接种后1周，检测小鼠右前肢腋部皮下肿瘤直径，若直径>10 mm，表示造模成功。造模成功的小鼠共有40只，随机分为模型组、顺铂组、吴茱萸碱组、顺铂+吴茱萸碱组，每组10只。

2.2 干预与标本取材

造模成功后次日开始干预，顺铂组用15 mg·kg-1·d-1顺铂灌胃，顺铂+吴茱萸碱组用15 mg·kg-1·d-1顺铂+15 mg·kg-1·d-1吴茱萸碱灌胃，对照组、模型组用等量生理盐水灌胃。每天灌胃1次，连续处理19周。末次灌胃24 h后，用脱颈法处死小鼠，在体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min，于超净台上取出结肠，纵行剪开，平铺，用磷酸盐缓冲液冲洗肠腔，观察肿瘤形成情况。一部分肿瘤组织以体积分数为4%的多聚甲醛固定，HE染色待检；另一部分置于液氮中冷冻待检。

2.3 各组小鼠肿瘤质量、肿瘤体积、肿瘤抑制率测定

解剖结直肠组织，取出其中的肿瘤组织，称质量。用游标卡尺测量肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积、肿瘤抑制率。肿瘤体积=(肿瘤长径×肿瘤短径×肿瘤短径)/2；肿瘤抑制率=(模型组小鼠肿瘤体积-其他组小鼠肿瘤体积)/模型组小鼠肿瘤体积×100%。

2.4 小鼠肿瘤组织中炎症因子指标测定

取小鼠肿瘤组织标本50 mg，加入磷酸盐缓冲液1 mL，置于液氮中研碎，于4 ℃条件下，以3 500 r·min-1离心15 min，离心半径10 cm，取上清液，按酶联免疫吸附测定试剂盒说明书步骤检测IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。操作方法：往预先包被的IL-6、IL-1β、TNF-α捕获抗体包被微孔中依次加入血清标本、对照品、HRP标记的检测抗体，温育洗涤后，用3,3,5,5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-tetramethylbenzidine，TMB)显色。用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度值，计算IL-6、IL-1β、TNF-α的质量浓度。

2.5 HE染色观察造模小鼠肿瘤组织的病理学变化

取经体积分数为4%多聚甲醛固定的肿瘤组织进行石蜡包埋，用切片机切片，厚度5 μm。用二甲苯脱蜡，置于体积分数为80%的乙醇中1 min，取出，用自来水冲洗1 min，用苏木素染色8 min，用质量浓度为0.1 g·L-1盐酸酒精溶液分化10 s，用自来水冲洗回蓝5 min，用伊红染色60 s，用体积分数为95%的乙醇调色10 s，用无水乙醇脱水1 min，用二甲苯透明1 min，用中性树胶封片，于显微镜下观察切片组织的病理学变化情况。

2.6 免疫组织化学法检测肿瘤组织内微血管密度

将玻片浸泡在浓硫酸中24 h，用自来水漂洗，干燥，浸入经稀释的多聚赖氨酸溶液5 min，烤干后浸入明胶溶液1 min，烘干制做免疫组织化学防脱片的玻片。免疫组织化学染色步骤：用载玻片捞片，烘干，取2.5项下制做的5 μm厚的石蜡切片常规脱蜡水化，用柠檬酸盐修复液高压修复，滴入一抗(鼠抗人CD34单克隆抗体)，4 ℃过夜，滴加二抗(酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，DAB显色，复染，脱水，封固，用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。参考微血管染色试剂盒说明书染色，于显微镜下观察。CD34染色呈阳性的细胞是血管内皮细胞，褐染的为新生血管内皮，肿瘤微血管被染为黄褐色。微血管密度(microvesse density，MVD)测定标准：棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇为一个血管计数，在(×100)视野内选取3个高密度血管区，转至(×200)视野计数每个区的血管数量，MVD为3个数值的平均值。

2.7 免疫组织化学法检测肿瘤组织中VEGF的水平

免疫组织化学检测依照VEGF免疫组织化学检测试剂盒说明书进行，阳性细胞呈棕黄色。按阳性细胞比，阳性细胞<5%为阴性，计0分；5%～25%计1分，>25%～50%计2分，50%以上计3分；按着色结果，无色计0分，淡黄色计1分，黄色计2分，棕黄色计3分。阳性细胞比、着色结果2项乘积≥2分为高表达。

2.8 Western blot检测肿瘤组织中IL-6R/STAT3通路相关蛋白的水平

取液氮冷冻的肿瘤组织，在磷酸盐缓冲液中洗涤，于4 ℃下用放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)缓冲液裂解30 min，12 000 r·min-1离心10 min后收集上清液。用BCA蛋白浓度定量试剂盒检测裂解的蛋白质量浓度。蛋白质裂解物经质量浓度120 g·L-1的SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜上，将PVDF膜以50 g·L-1脱脂奶粉封闭4 h，与兔抗小鼠IL-6R、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、survivin、β-actin单克隆抗体(一抗)在4 ℃孵育过夜，再与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗孵育4 h。用电子化学发光试剂盒检测条带，用Image J软件进行定量分析。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 小鼠肿瘤质量、体积及肿瘤抑制率

各组小鼠的肿瘤质量、体积及肿瘤抑制率组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，吴茱萸碱组、顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组小鼠的肿瘤质量较轻、肿瘤体积较小(P<0.05)；与吴茱萸碱组比较，顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组小鼠的肿瘤质量较轻、肿瘤体积较小、肿瘤抑制率较高(P<0.05)；与顺铂组比较，顺铂+吴茱萸碱组小鼠的肿瘤质量较轻、肿瘤体积较小、肿瘤抑制率较高(P<0.05)。结果见表1。

表1 各组小鼠肿瘤质量、体积及肿瘤抑制率的比较

3.2 小鼠肿瘤组织中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平

各组小鼠肿瘤组织中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，吴茱萸碱组、顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组IL-6、IL-1β和TNF-α的水平较低(P<0.05)；与吴茱萸碱组比较，顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组IL-6、IL-1β和TNF-α的水平较低(P<0.05)；与顺铂组比较，顺铂+吴茱萸碱组IL-6、IL-1β和TNF-α的水平较低(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组小鼠肿瘤组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平的比较

3.3 小鼠肿瘤组织的病理学

模型组小鼠肿瘤组织中可见大片灶性坏死，细胞核增大、深染，大小不一，排列紊乱，有异形表现，呈典型恶性肿瘤细胞形态特征，肿瘤细胞密集；吴茱萸碱组、顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组小鼠的肿瘤细胞核固缩、变小，肿瘤细胞形态破坏，密度依次降低，肿瘤组织内坏死区依次增大。结果见图1。

3.4 小鼠肿瘤组织内MVD

经免疫组织化学SABC法染色后切片，镜下观察血管内皮细胞被褐染，模型组可见微血管广泛分布于组织间质内，部分无管腔、不规则，大小、形态各异，吴茱萸碱组、顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组微血管相对少见，且微血管数量依次减少。结果见表3、图2。

3.5 小鼠肿瘤组织中VEGF的表达

VEGF在小鼠肿瘤组织中的阳性表达为棕黄色，主要表达于细胞质。模型组VEGF蛋白阳性表达较强，吴茱萸碱组、顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组VEGF蛋白的表达量依次下降。结果见图3。

图1 各组小鼠肿瘤组织的HE染色结果(×200)

表3 各组小鼠肿瘤组织内

3.6 小鼠肿瘤组织中IL-6R等的表达水平

各组小鼠肿瘤组织中STAT3蛋白的表达水平组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，IL-6R、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白的表达水平组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，吴茱萸碱组、顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组的IL-6R、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白的表达水平较低(P<0.05)；与吴茱萸碱组比较，顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组的IL-6R、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白的表达水平较低(P<0.05)；与顺铂组比较，顺铂+吴茱萸碱组的IL-6R、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白的表达水平较低(P<0.05)。结果见表4、图4。

图2 各组小鼠肿瘤组织内MVD(×200)

表4 各组小鼠肿瘤组织中IL-6R、STAT3、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白表达水平的比较

4 讨论

结直肠癌是源自大肠腺上皮的一种恶性肿瘤，可发生于各段大肠，目前尚未阐明其病因，主流观点认为结直肠癌的发生与生活方式、饮食结构、环境、遗传等因素相关[7]。结直肠癌在全球的发病率仅次于肺癌和乳腺癌，病死率在恶性肿瘤中亦位居前列，对人类健康、生命构成重大威胁。我国结直肠癌的发生率低于大部分发达国家，但病死率较高。

图3 各组小鼠肿瘤组织中VEGF的表达(×100)

注：A.模型组；B.吴茱萸碱组；C.顺铂组；D.顺铂+吴茱萸碱组。

如何降低患者病死率、改善预后，一向是相关学科研究人员的重点课题[8]。中医药治疗恶性肿瘤有悠久的历史，并确有疗效。近年来，对中药及其活性成分诱导肿瘤细胞凋亡的报道日趋增多，其中吴茱萸碱广受关注。吴茱萸碱有抗炎、抑制血管生成、调节免疫等多种功效。有研究证明[9]，吴茱萸碱在人骨肉瘤等恶性肿瘤的抑制中有一定作用，但是否为广谱抗肿瘤活性物质，在体内对人结直肠癌生长有无影响，尚不明确。

本研究通过建立结直肠癌小鼠模型观察吴茱萸碱的抑瘤功效。从模型组到吴茱萸碱组、顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组，小鼠肿瘤质量依次减轻、肿瘤体积依次减小；HE染色发现小鼠肿瘤细胞核固缩、变小，肿瘤细胞形态破坏，肿瘤组织内坏死区依次增大，均提示吴茱萸碱对结直肠癌有抑瘤作用。近年来，研究人员将炎症列为肿瘤的第7个特征后，关于肿瘤与炎症关系的报道增加，并逐渐深入到分子水平[10]。研究发现[11]，大多数出现细胞老化的实体瘤的诱发因素是由炎症机制调控的，随着肿瘤发展，炎症干扰宿主免疫反应，且可辅助肿瘤免疫治疗。基于炎症与肿瘤的关系，本研究挑选了最近研究热度较高的炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α作为研究指标。IL-6是多功能细胞因子，参与免疫细胞调节、细胞增殖与分化、血细胞形成等生理过程，可通过调节细胞周期相关基因，促进肿瘤血管生成，其在肿瘤发生、发展中的作用已在多种人类肿瘤研究中被证实[12-14]。TNF-α参与多种生理、免疫过程，是炎症环境中心调节因子。IL-1β可促进炎症细胞因子表达，增加内皮细胞、上皮细胞的通透性。这些炎症因子共同作用可加重肠黏膜炎症，损坏肠黏膜屏障。MARTNEZ-REZA I等[15]研究发现，IL-1β和TNF-α可促进上皮细胞类型的乳腺癌细胞转化为间充质干细胞，转移性、侵袭性增强。结直肠癌细胞同属于上皮细胞类型，IL-1β和TNF-α亦可能诱导结直肠癌细胞发生上皮间质转化，发挥肿瘤干细胞特点。本研究结果显示，从模型组到吴茱萸碱组、顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组，小鼠肿瘤组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平依次下降，提示IL-6、IL-1β和TNF-α水平的变化与结直肠癌的进展相关，吴茱萸碱可通过抑制上述炎症因子的表达发挥抗炎作用。研究发现[16]，结直肠癌是富血管恶性肿瘤，血管形成可为结直肠癌细胞提供丰富的营养物质与氧，从而促进恶性肿瘤的恶性生物学行为，因此抗血管生成是治疗恶性肿瘤的靶点之一。抗血管生成药物可切断恶性肿瘤细胞养分补给，阻断癌细胞侵袭、转移的血行通道，顺铂等药物即具备上述功效，但存在诸多不良反应。中医药在肿瘤治疗中有多靶点、不良反应小、价格低廉等优势，可弥补靶向抗肿瘤血管治疗的缺陷。尹元元等[17]研究发现，吴茱萸碱有抗血管生成的活性。VEGF是已发现的主要促血管生成因子之一，该蛋白可与结直肠癌病灶组织中血管内皮细胞表面受体特异性结合，发挥促新生血管形成的作用。在本实验中，从模型组到吴茱萸碱组、顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组，肿瘤组织中VEGF表达水平依次下降、微血管数量依次减少，提示吴茱萸碱、顺铂均可体外抑制血管生成相关蛋白的表达，并能影响肿瘤内MVD，二者联合时的抗肿瘤血管生成效果更佳。

STAT是一种参与细胞信号转导、转录激活的重要转录因子，STAT3为STAT家族的重要成员，在结直肠癌发展前期，其活化(磷酸化)激活了炎症通路，破坏肠黏膜屏障[18-19]。据报道[20]，在结直肠癌中，p-STAT3是预测肿瘤浸润程度的重要因素之一。徐湖波等[21]推测下调p-STAT3蛋白是抑制结直肠癌细胞增殖与侵袭的机制之一。以上研究表明STAT3在结直肠癌发展中发挥重要作用。IL-6对细胞存活、免疫应答、细胞凋亡以及增殖有重要作用，可与IL-6受体结合形成复合物，与细胞膜表面的gp130结合，促使STAT3磷酸化，p-STAT3结合特定的DNA序列，引起一系列促增殖蛋白(如cyclin D1)和抗凋亡蛋白(如survivin)的表达，从而导致肿瘤的发生。本研究结果显示，模型组、吴茱萸碱组、顺铂组和顺铂+吴茱萸碱组IL-6R、p-STAT3、cyclin D1和survivin蛋白水平依次下降，提示吴茱萸碱对IL-6R/STAT3通路相关蛋白有抑制作用，这可能是其抑制结直肠癌的机制之一。

综上所述，吴茱萸碱对结直肠癌小鼠有抑瘤作用，可能通过抑制IL-6R/SART通路实现。吴茱萸碱在结直肠癌治疗中的应用尚处于起步阶段，未来需要大量动物实验乃至临床试验深入研究。