智三针对血管性痴呆小鼠前额叶和海马小清蛋白、生长激素抑制素、神经肽Y神经元表达的影响

2022-03-24杨培丹贺君谭穗

广州中医药大学学报 2022年3期

杨培丹，贺君，谭穗

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405；2.广州中医药大学，广东广州 510405）

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是指各类脑血管疾病（如出血性或缺血性脑卒中）引起的脑功能障碍而产生的阶梯性神经退行性疾病[1-2]，患病率约占痴呆患者总数的30.6%[3]。与阿尔茨海默症（Alzheimei’s disease，AD）的区别点在于，VD是可防治的一种可逆性神经退行性疾病[4]。VD的发生、发展涉及复杂的病理、生理过程，与神经递质系统紊乱[5]、氧化应激反应[6]、神经炎症[7]和Ca2+代谢异常[8]密切相关。然而，目前尚未有明确批准用于治疗VD的特效药物和干预措施。前期研究显示，与西药对照组相比，以智三针为主的针刺治疗组能够改善VD患者的学习认知记忆能力及生活自理能力[9]，具有安全性高、毒副作用小的优点，但其机理目前尚未完全阐释。研究表明，前额叶、海马结构参与学习、工作记忆等高级认知功能的发生及发展过程，两者间存在神经纤维投射[10]。抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）中间神经元表达量的下降，如相关的亚型神经元小清蛋白（PV）、生长激素抑制素（SST）和神经肽Y（NPY）与认知记忆功能障碍密切相关[11]。因此，脑组织缺血缺氧条件下，海马-前额叶的神经环路、脑内GABA神经递质紊乱，可能与VD的出现有关。本研究通过构建VD小鼠模型，观察电针智三针对VD小鼠的行为学改变及GABA亚型PV、NPY和SST神经元表达的影响，探讨智三针治疗VD的可能机理，为临床应用智三针治疗VD提供实验依据。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物40只SPF级雄性C57BL6J小鼠，8～10周龄，体质量（25±3）g。由广州中医药大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK（粤）2018-0034]，在广州中医药大学华南针灸研究中心适应性喂养1周后进行实验。实验操作及实验流程严格按照颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》[12]。

1.2 主要仪器与设备新物体实验箱及Digbehv动物行为视频分析软件（上海吉量软件科技有限公司提供）；Y迷宫实验箱及Digbehv动物行为视频分析软件（上海吉量软件科技有限公司提供）；华佗牌一次性无菌针灸针（规格0.25 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司提供）；电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司提供）；动脉止血夹（深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供）；激光共聚焦显微镜（Nikon公司提供）；冰冻切片机（Thermo公司提供）。

1.3 主要试剂异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供）；抗PV抗体、抗SST抗体、抗NPY抗体、山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor®488，Abcam上海贸易有限公司）。

1.4 分组与造模从40只雄性C57BL6J小鼠中随机选取32只进行造模，其余8只设为假手术组。按照此前文献的VD小鼠模型造模方案[13]，以可逆性夹闭双侧颈总动脉法建立VD小鼠模型。造模方法如下：经异氟烷气麻后，将小鼠的四肢固定在泡沫塑料板上，颈部进行消毒，用弯剪除去颈部毛发，以镊子钝性分离颈部动脉和迷走神经后，用动脉夹反复夹闭双侧颈总动脉20 min，再通10 min，重复3次。假手术组小鼠仅用无菌镊分离两边的颈总动脉和迷走神经。手术后将小鼠放入保暖箱中，等待苏醒，注意查看生命体征。术后14 d，使用Y迷宫和新物体实验进行模型检验，若行为学数据低于2倍标准差[14]，表明造模组小鼠存在空间工作记忆障碍。将造模成功的小鼠随机分为智三针组、模型组和非穴组，每组各10只。

1.5 干预方法选择在造模成功的次日进行干预治疗。（1）智三针组：参照《实验针灸学》动物穴位定位标准[15]，以“神庭”（即百会穴正中前下方约2 mm处）、“本神”（即神庭穴两侧旁开0.5 mm，共2穴）作为针刺点。针刺深度在2～3 mm，平刺，双侧本神接入电针仪正负极，设定为疏密波（频率为20 Hz），留针20 min，每日1次，干预28 d。（2）非穴组：参考文献的定位方法[16]，选取两侧肋弓旁、距髂嵴10 mm为针刺部位，针刺深度在2～3 mm，斜刺，针刺后接入电针仪，疏密波（频率为20 Hz），留针20 min。（3）模型组和假手术组：无需电针干预，抓取、固定，置气麻箱中20 min，每日1次，干预28 d。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 行为学观察

（1）新物体识别实验：正式实验前24 h，将小鼠在行为学箱中适应5 min，无需置放任何物体。正式实验第1天，在行为学箱中放置形状和大小相同的物体，记录小鼠10 min探索物体的时间。正式实验第2天，替换为一个形状和颜色不同的物体，记录小鼠5 min内探索新物体和旧物体的时间。每次实验结束后用75%酒精清洁物体和行为学箱。辨别指数=（探索新物体的时间-探索旧物体的时间）/两物体总探索时间。

（2）Y迷宫实验：正式实验前将小鼠搬运到行为学房间中熟悉环境1～2 h。正式实验开始后，在一个三边等长臂组成的Y迷宫行为装置中，随机选取其中一个臂，小鼠被任意背对放置在其中一臂的末端，记录小鼠8 min自由进入各臂的顺序（即自发交替行为，计算自发交替率）和总进臂次数。

1.6.2 免疫荧光染色法观察各组小鼠前额叶和海马CA1区的PV、NPY、SST神经元表达情况行为学实验结束后对小鼠进行灌流、取材、固定后进行冰冻切片。从每组中随机挑选4只小鼠的前额叶皮层和海马CA1区的脑片，用1×PBS清洗3次，用0.3%TritonX-100加入5%山羊血清进行通透和封闭1 h。随后，分别加入PV抗体（1∶1 000稀释）、NPY抗体（1∶200稀释）和SST抗体（1∶200稀释），放置于4℃冰箱中，摇床孵育过夜。第2天，回收一抗后，加入山羊抗兔IgG（1∶1 000稀释），室温下摇床上孵育60 min，加入DAPI（1∶1 000稀释）进行染核，8 min后进行清洗、封片。第2天，激光共聚焦显微镜进行拍摄，计算各组PV、SST、NPY神经元平均值。

1.7 统计方法采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。根据正态性检验结果，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组资料组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）检验。为进一步了解组间有无显著性差异，采用LSD法检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。以ImageJ 8.0软件用于神经元计数。

2 结果

2.1 各组小鼠行为学实验结果比较新物体实验结果：与假手术组比较，模型组的新物体辨别系数减少，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，智三针组新物体辨别系数显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。Y迷宫实验结果：与假手术组比较，模型组的自发交替率下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，智三针组的自发交替率增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，智三针组的总进臂次数增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。行为学实验结果见表1。

表1 各组小鼠治疗后认知行为学变化比较Table 1 Comparison of cognitive behavioral changes in mice of various groups after treatment （±s）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别智三针组非穴组模型组假手术组总进臂次数/次59.83±19.60 55.62±10.78 52.67±11.45 50.50±9.90鼠数/只10 10 10 8旧物体辨别系数0.37±0.16 0.34±0.27 0.28±0.24 0.36±0.18新物体辨别系数0.41±0.14②0.35±0.33 0.27±0.16 0.49±0.37自发交替率/%60.04±8.97②55.46±10.16 50.18±9.69①64.79±10.12

2.2 各组小鼠前额叶皮层PV、NPY、SST神经元数量变化比较治疗后，与假手术组比较，模型组的前额叶皮层的PV、NPY、SST神经元表达量显著下降（P＜0.05）。与模型组比较，智三针组的前额叶皮层的PV、NPY神经元表达量增加（P＜0.05）。与模型组比较，智三针组前额叶皮层的SST神经元表达量增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

表2 各组小鼠前额叶皮层中PV、SST和NPY神经元数量比较Table 2 Comparison of the quantity of PV，SST and NPY neurons in mouse prefrontal cortex in various groups （±s，个）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

NPY 42.10±5.56②37.17±6.74 24.42±7.12①72.52±6.23组别智三针组非穴组模型组假手术组鼠数/只8 8 8 8 PV 164.17±33.47②114.43±39.08 90.56±46.25①190.26±27.36 SST 80.50±11.27 85.67±18.90 71.67±6.89①121.67±16.80

2.3 各组小鼠海马CA1区PV、NPY、SST神经元数量变化比较治疗后，与假手术组比较，模型组海马CA1区PV、NPY、SST神经元表达量显著下降（P＜0.05）。与模型组比较，智三针组的海马CA1区PV、NPY神经元表达量显著上升（P＜0.05）。与模型组比较，智三针组海马CA1区SST神经元表达量增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表3和图1。

图1 各组小鼠前额叶、海马CA1区PV、NPY、SST神经元数量比较（×20）Figure 1 Comparison of the expression of PV，NPY and SST neurons in the prefrontal lobe and hippocampus CA1 area in mice of various groups（×20）

表3 各组小鼠海马CA1区中PV、SST和NPY神经元数量比较Table 3 Comparison of the quantity of PV，NPY and SST neurons in the prefrontal and hippocampal CA1 regions in mice of various groups （±s，个）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

NPY 29.53±10.13②21.07±8.76 15.23±12.05①39.42±6.38组别智三针组非穴组模型组假手术组鼠数/只8 888 PV 49.26±10.17②45.42±11.09 25.18±10.75①77.06±12.24 SST 28.16±10.14 30.51±6.45 27.75±4.37①54.42±10.74

3 讨论

有效建立稳定的、可复制的血管性痴呆（VD）动物实验模型是研究VD病理、生理机制的重要前提之一。关于VD模型的制备方法，包括有双血管阻断法、四血管阻断法、永久性双侧颈总动脉阻断法、血管内栓塞法等[17]。本次实验采取双血管可逆性阻断法，该手术可复制性高，造模失败率较低，模型稳定性较好[18]。通过反复夹闭双侧颈总动脉，脑组织反复缺血再灌注损伤，引起大脑前额叶和海马CA1区的结构损伤和功能改变，最终导致认知损伤和VD的发生。由于C57BL6J小鼠后交通动脉不发达的特性[19]，对脑缺血缺氧极度敏感，最终，我们选择了雄性C57BL6J小鼠，采用双血管可逆性阻断法进行VD造模。

“靳三针”疗法[20]是由我国著名针灸名医靳瑞教授结合多年的临床实验和经验，以及借鉴历代针灸专家和学者的经验和研究成果，开发出来的一门独特的针灸学派。其中，智三针是靳三针疗法中与脑血管疾病紧密相关的一组穴组，包括神庭穴和两侧本神穴，主要位于前额，被认为可以治疗与精神和认知功能障碍相关的疾病[21]。依据穴位的近治效应，智三针穴组处于大脑额叶头皮层，与前额叶相对应，对涉及认知、情绪、精神、思维等方面进行调节[22]。此外，神庭穴是督脉上的穴位，与足太阳膀胱经相会，且皆入络于脑；本神穴是在足少阳胆经上的穴位，与阳维脉相交会，两者合同，既可调督脉与胆经经气，又可调神、益智。由此看出，智三针疗法在治疗如血管性痴呆等智力减退疾病方面，具有独特优势。

目前，对于智三针改善VD认知障碍的作用机理尚未完全清楚，相关研究表明，神经递质系统障碍可能在VD的发生、发展过程中起到关键性的作用[23]。VD可能损伤一些与认知相关的大脑皮质区域（海马、额叶、杏仁核），导致神经递质如乙酰胆碱、GABA的紊乱[24]。既往研究表明，VD和AD模型鼠出现认知功能的减退可能与海马GABA神经元的减少紧密相关[25]。PV、NPY和SST是GABA神经元中重要的3个亚型，能调节和促进海马神经元网络兴奋性，改善认知功能障碍。在有认知功能缺陷的VD或AD模型中，观察到PV神经细胞的数量显著下降，推测PV的神经元与空间学习中认知相关，PV可能通过调节γ振荡节律来改善认知功能障碍[11]。NPY神经元可以调节认知、食物摄入、昼夜节律等人体相关的生物功能，可以起到神经保护的作用[26]。有学者发现，注射一定剂量的SST可以提高VD模型鼠的学习记忆能力，改善模型鼠认知记忆障碍[27]。本研究结果显示，与模型组比较，智三针组的前额叶区和海马CA1区PV和NPY神经元表达量显著增加。提示电针智三针可以上调前额叶和海马CA1区PV、NPY神经元的表达量，改善小鼠的认知记忆能力。

综上所述，电针智三针可以提高VD小鼠脑组织前额叶和海马CA1区的PV和NPY神经元的表达，改善VD小鼠的行为学，发挥保护神经元的作用。本研究从分子生物学层面证实了智三针对VD认知障碍的改善作用，其作用机制可能与上调小鼠前额叶和海马CA1区的PV和NPY神经元表达，促进神经元再生有关。