三叉神经电刺激对创伤性脑损伤小鼠认知功能障碍的作用

刘黎嘉琪 徐静 范胜诺 杨仟 伍少玲 马超

创伤性脑损伤（TBI）是一种临床上常见的外 伤性疾病，它不仅会给患者带来运动、言语功能障碍，还会使患者产生认知障碍［1，2］。研究表明，TBI病史会提高人群患阿尔兹海默病（AD）、帕金森综合征等痴呆疾病的风险，也增加delta 裂解酶（AEP）加速APP 的裂解，促进β-淀粉样蛋白（Aβ）的产生［3，4］。这表示TBI 可能会使大脑AD 相关病理进展加快，并最终导致认知损害。在临床康复中，虽然有深部脑刺激、迷走神经电刺激等用于TBI 后的治疗［5，6］，但对TBI 所产生的认知障碍，仍然缺少安全有效的干预手段。三叉神经电刺激（TNS）对抑郁症、癫痫、意识障碍等疾病有改善作用［7-9］。TNS 可以引起交感神经和副交感神经系统的协同作用，产生交感神经介导的系统血压低频振荡模式，减轻全身炎症，改善失血性休克的结局［10］。此外，研究发现，TNS 可以显著激活下丘脑外侧核和三叉神经脊核的神经元活动，提高昏迷大鼠的脑电信号，促进意识恢复，TNS 还可以促进海马区细胞增殖，并激活孤束核、蓝斑等脑区的神经活动［11］。本研究采用TNS 治疗TBI 后小鼠的认知障碍，并探讨其可能的机制，为TBI 后的认知障碍患者提供新的治疗方案。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF 级C57BL/6J 小鼠60 只，周龄8-12 w，体重（26±3）g，均购于中山大学实验动物中心［生产许可证号码SCXK（粤）2016-0029］。实验过程中，小鼠以每笼5-6 只饲养于温度恒定，保持12 h 昼夜循环的环境下，并提供充足的水与饲料。所有操作均符合中山大学实验动物伦理规章制度，经由中山大学实验动物福利伦理审查小组批准。

1.2 分组与造模 将60 只小鼠均分为3 组，分别是假手术组（sham）、脑损伤组（TBI）和电刺激组（TNS）各20 只。参考相关文献［12］，在异氟烷气体麻醉下采用自由落体（Weight-Drop）模型，构建小鼠TBI 模型，sham 组只行头皮切开及缝合操作，各组麻醉时间保持一致，手术结束后放回笼内，予保暖至小鼠正常苏醒。

1.3 仪器与试剂材料 （1）仪器：小动物气体麻醉机（R500 通用型，瑞沃德生命科技有限公司）、自由落体撞击器（瑞沃德生命科技有限公司）、电刺激仪器（A-M System）、Morris 水迷宫视频分析系统（上海欣软信息科技有限公司）、蛋白质免疫印迹电泳槽（BIO-RAD）、免疫荧光自动扫片仪（Leica）。（2）试剂：抗LC3A/B 抗体（Cell Signaling Technology）、抗Iba1 抗 体（Wako）、抗APP 抗 体（Abcam）、BCA 蛋白检测试剂盒（Thermo Fisher）。

1.4 三叉神经电刺激方案 造模结束后第1 h 与24 h，在异氟烷气体麻醉下，于3 组小鼠三叉神经V2 支体表处安放电极，进行双侧电刺激，sham 组与TBI 组不通电。刺激参数：频率40 Hz；电流0.1mA；30s on，30 soff；持续30 min。

1.5 行为学评估 造模结束后第48 h，参考相关文献［13］，对每组各10 只小鼠进行Morris 水迷宫测试。测试共6 天。第1 天行可见平台训练，设置一个可见平台，将小鼠从各个象限背对水池放入池中120 s 寻找平台，使其适应环境并测试其游泳能力，避免因脑损伤造成行动受限而影响实验结果。第2-5 天进行隐藏平台测试，将平台放于SE象限，每天从不同象限将小鼠放入水池中120 s 寻找平台，若小鼠在120 s 内找到平台则让其在上面停留15 s，如果超过120 s 小鼠仍未找到平台，则引导其在平台上停留15 s。第6 天进行探索测试，将平台拿走，从SW 象限放入小鼠，测试小鼠的空间记忆能力。每天测试均在固定时间进行，测试结束后小鼠进行保暖烘干，放回笼中。

1.6 蛋白质免疫印迹 造模结束后48 h，每组各5 只，在异氟烷深度麻醉下断头取脑，每只小鼠取海马，液氮速冻后置于-80℃冰箱中保存，待所有样本取材完成后进行Western Blot（WB）实验。将小鼠海马样本加入含有蛋白酶抑制剂的强RIPA裂解液，使用自动冷冻研磨机进行组织匀浆，提取蛋白。采用BCA 法测定蛋白浓度后使蛋白变性，后进行上样、电泳分离，并转膜至PVDF 膜上，使用5%脱脂奶粉封闭1 h 后，4℃孵育一抗过夜。次日使用TBST 洗涤后室温孵育二抗1 h，再洗膜进行显影，获得图像后使用Image J 软件进行灰度分析。

1.7 免疫荧光技术 造模结束第48 h，经心脏灌注生理盐水与4%多聚甲醛取脑，全脑置于4%多聚甲醛中，在4℃下固定24 h。固定后将样本浸泡在30%蔗糖溶液中脱水48 h，使用OCT 包埋剂包埋，在冰冻切片机中进行切片，片厚40 μm。切片后使用PBS 洗净包埋剂，PBST（0.4%Triton X-100）配置10%山羊血清封闭，封闭后使用一抗4℃过夜。次日将标本置于室温2 h 后，使用PBST 洗涤，避光使用对应荧光二抗，室温孵育2 h。PBST 洗涤后以DAPI 染色，后将切片转于载玻片上，并滴加荧光抗淬灭剂，盖上盖玻片。

1.8 统计学分析 使用SPSS 25.0 软件与Graphpad Prism 8 进行统计学分析与绘图。数据均以（±s）形式体现，数据符合正态分布，若方差齐则采用单因素方差分析法，方差不齐采用K-W 检验。以P＜0.05 为有显著性差异。

2 结 果

2.1 三组TBI 小鼠的认知能力比较 Morris 水迷宫测试中，TBI 组小鼠和TNS 组小鼠之间的平均游泳速度并无差异，首先排除了TBI 有可能导致的运动功能损伤给认知测试带来的影响。在第6 日的测试中，TNS 组小鼠的平台穿越次数与目标象限时间占比两个指标都明显优于TBI 组小鼠（P＜0.05）。见图1。

图1 Morris 水迷宫测试结果（注：与TBI 组进行比较，*表示P＜0.05）

2.2 三组TBI 后小鼠海马自噬水平与清除能力比较 TNS 组小鼠的海马区LC3 表达水平显著升高（P＜0.01），见图2。在TNS 组小鼠海马组织中，Iba1 表达水平显著高于TBI 组（P＜0.01），见图3。

图2 各组海马区LC3 蛋白表达水平（注：与TBI 组进行比较，**表示P＜0.01）

图3 各组海马APP 蛋白表达水平各组小鼠海马区Iba1 免疫荧光染色与Western Blot 中Iba1 蛋白表达水平

2.3 三组TBI后APP水平的比较 在损伤后48 h，APP 的累积较TBI 组明显减少（P＜0.05），见图4。

图4 各组海马APP 蛋白表达水平（注：与TBI 组比较，*表示P＜0.05）

3 讨 论

本研究结果显示，TNS 治疗可改善TBI 小鼠的空间记忆功能，TNS 显著改善了TBI 后小鼠大脑的自噬水平，并在急性期激活了更多的小胶质细胞，减轻了Aβ 相关蛋白的累积，故推测改善认知能力的机制与此相关。

3.1 损伤后大脑的自噬水平改变 由于溶酶体功能障碍，导致早期自噬底物sequestosome 1 的累积，使自噬水平受到影响，这样的累积在TBI 后1-3天达到峰值并最终导致大脑神经元的死亡，在TBI后1 天通过抑制PLA2G4A/cPLA2 恢复自噬水平，能够逆转TBI 小鼠大脑皮层和海马的神经元死亡情况，并改善小鼠的运动协调性［14，15］。这表明自噬水平可作为TBI 后干预的一个重要靶点。外力冲击大脑造成轴突损伤，并伴随APP 大量累积在此类受损轴突中，APP 是Aβ 的前体蛋白，这可能是大量研究中TBI 后Aβ 斑块积聚的原因。有研究使用药物治疗TBI 通过改善自噬水平，减轻了APP 与Aβ 的负荷，并最终改善了小鼠的认知障碍［16］。因此，在TBI 急性期保证自噬功能的正常水平，可减轻TBI 给大脑带来的不良病理变化，对后续的功能恢复有重大意义。本研究观察到TNS组小鼠海马组织自噬标志物LC3 水平的增高，并伴随着APP 水平的下降，说明TNS 对TBI 可以有较显著的治疗效果。

3.2 小胶质细胞在TBI 中的作用 小胶质细胞是TBI 的第一类反应者，在中枢神经系统中扮演“哨兵”的角色。在TBI 的急性期，小胶质细胞可以快速将自身分支向受损部位延伸，并向受损部位进行定向迁移，限制受损的扩散；脑血管旁的小胶质细胞通过嘌呤能受体P2RY12 介导可以在血脑屏障受损时帮助其修复闭合，维持大脑血脑屏障［17］。Nagamoto-Combs 等在恒河猴受到TBI 的大脑中发现，病变部位周围小胶质细胞还可以表达神经营养因子及其对应受体，在其长期的恢复过程中有营养性的作用［18］。在Willis 等的实验中，TBI 后重新填充增殖的小胶质细胞可以通过白细胞介素-6 促进海马神经细胞的发生，从而帮助TBI 后认知障碍的恢复［19］。对TBI 后神经免疫学范式转变时间点总结的综述也表明，在TBI 后的急性期，小胶质细胞的增多，有利于TBI 后期的恢复［20］。而在本研究中，在急性期通过TNS 治疗可使小胶质细胞增多，这可能增强了小胶质细胞对受损部位的吞噬、清除以及神经保护能力。

综上所述，TNS 作为一种安全、有效的治疗TBI 的手段，可以提高认知能力，其机制可能与提高TBI 后的自噬水平和小胶质细胞的清除保护能力，减轻Aβ 相关蛋白的负荷相关。