ERK抑制剂U0126对氧糖剥夺再灌注致神经母细胞瘤细胞损伤的影响

李德丽 胡婉湘 蒋嫦月 谢露

缺血性脑血管疾病是临床上的常见病，具有高致死率和致残率的特点［1］，临床首要治疗方案是恢复缺血区域的血流供应，但在恢复血流供应的同时出现继发性脑组织损伤和功能障碍，称为脑缺血再灌注损伤（CIRI）［2］。CIRI 的病理机制主要是发生氧化应激损伤，甚至是细胞死亡［3-5］。课题组研究发现，ERK 抑制剂PD98059 改善心跳骤停/心肺复苏大鼠的神经功能，减轻细胞凋亡［6-7］。同为ERK 抑制剂U0126 在心肌缺血/再灌注模型中减轻心肌细胞凋亡［8］；在心脏移植模型中，减轻持续的冷损伤［9］；在高尿酸血症肾病模型中减轻肾小管细胞损伤［10］；课题组前期用SH-SY5Y 细胞在体外构建OGD/R 模型模拟体内CIRI 模型，表明U0126 可提高细胞的生存率［11］。其抗氧化和抗细胞凋亡作用有待进一步探究。本实验应用SHSY5Y 细胞OGD/R 模型，设置U0126 三个剂量组，探究其对经OGD/R 处理后SH-SY5Y 细胞的SOD 活性、细胞凋亡的影响及量效关系。

1 材料与方法

1.1 主要材料 SH-SY5Y 细胞购自武汉大学细胞库，MEM 培养基、胎牛血清和DMSO 购自Gibco 公司，CCK-8 购自新赛美生物科技有限公司，LDH、SOD 检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；U0126 购自美国Selleck 公司；PBS、胰酶、青链霉素、蛋白磷酸酶抑制剂、RIPA 购自北京索莱宝有限公司；PI 试剂盒购自美国赛默飞公司。

1.2 实验方法 取SH-SY5Y 细胞复苏后种在含5%胎牛血清和1%青链霉素完全培养基中，于37 ℃、5% CO2的培养箱培养，待细胞密度达80-90%时，用胰酶消化后离心，重悬后可传代及铺板。将细胞随机分为正常对照组（Control 组）、模型组（OGD/R 组）、溶剂组（DMSO 组）、U0126 10 μmol/L 组（U0126-L 组）、U0126 20 μmol/L 组（U0126-M 组）和U0126 30 μmol/L 组（U0126-H组）。待细胞密度达60-80%时给U0126 处理，Control 和OGD/R 两组换完全培养基，DMSO 组换含0.06%DMSO 的培养基，U0126-L 组、U0126-M 组和U0126-H 组 分 别 换U0126 浓 度 为10、20、30 μmol/L 的培养基。U0126 作用24 h 后，除Control组换完全培养基外，其余组制备OGD/R 模型，即更DMEM 无糖培养基并通入氮气使细胞缺糖缺氧，2 h 后换完全培养基，于37 ℃、5% CO2的培养箱培养24 h。

1.3 CCK-8 法检测细胞存活率 根据CCK-8 法检测试剂盒说明书，将细胞按2×105个/孔种植于96 孔板，制备OGD/R 模型后每孔加100 μL CCK-8反应液，37℃孵育2 h。用酶标仪测定450nm 处的吸收光。

1.4 酶标法检测培养液的LDH 活性 将细胞按1×106个/孔种植于6 孔板，制备OGD/R 模型后收集细胞培养液，根据LDH 检测试剂盒说明书在96 孔板加样后摇匀，用酶标仪测定450nm 处的吸收光。

1.5 SOD 活性检测 将细胞按1×106个/孔种植于6 孔板，制备OGD/R 模型后提取细胞蛋白并测蛋白浓度，按照SOD 检测试剂盒说明书在96 孔板板中加入相应的试剂，37℃孵育30 min，用酶标仪测定450nm 处的吸收光。

1.6 流式细胞术检测细胞死亡率 根据PI 死染法说明书，将细胞按5×105个/孔种植于12 孔板，制备OGD/R 模型后收集细胞培养液及细胞并用PBS冲洗两次，将细胞悬液在5 μg/mL PI 染液中孵育，用流式细胞仪测量10000 个细胞/样本在488nm 波长激发的荧光强度，通过f12 通道记录PI 的荧光强度。

1.7 统计学分析 使用统计软件SPSS23.0 进行分析，计量资料结果以（）表示。使用单因素方差分析（One-Way ANOVA）计算各组组间均值差异，以P＜0.05 为两组间比较差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 CCK-8 法 检 测U0126 对SH-SY5Y 细 胞OGD/R 后细胞存活率的影响 Control 组细胞数量多，排列紧密，状态好且轮廓清晰。与Control 组比较，OGD/R 组细胞数量明显减少，排列疏散，状态差且形态不规则，存活率显著降低（P＜0.05）。与OGD/R 组比较，U0126 各组细胞数量明显增加、形态趋于规则，存活率显著升高（P均＜0.05），显示出剂量依赖性，U0126-H 组显著高于U0126-L 组（P＜0.05）。DMSO 组与OGD/R 组差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 U0126 对OGD/R 后细胞存活率的影响（n=3）

2.2 U0126 对SH-SY5Y 细胞OGD/R 后细胞培养液LDH 活性的影响 与Control 组比较，OGD/R 组细胞培养液LDH 活性显著增高（P＜0.05）。与OGD/R 组比较，U0126 各组细胞培养液LDH 活性显著降低（P均＜0.05），显示出剂量依赖性，U0126-H 组显著低于U0126-L 组（P＜0.05）。DMSO 组与OGD/R 组差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2 U0126 对OGD/R 后细胞培养液LDH 活性的影响（n=3）

2.3 U0126 对SH-SY5Y 细 胞OGD/R 后 细 胞SOD 活性的影响 与Control 组比较，OGD/R 组细胞中SOD 活性显著下降（P＜0.05）。与OGD/R 组比较，U0126 各组细胞中SOD 活性显著增加（P均＜0.05），显示出剂量依赖性，U0126-H 组显著高于U0126-L 组（P＜0.05）。DMSO 组与OGD/R 组差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图3 U0126 对OGD/R 后细胞SOD 活性的影响（n=3）

2.4 流式细胞术检测U0126 对SH-SY5Y 细胞OGD/R 后细胞凋亡率的影响 与Control 组比较，OGD/R 组细胞凋亡数量显著增加（P＜0.05）。与OGD/R 组比较，U0126 各组细胞凋亡数量显著减少（P均＜0.05），显示出剂量依赖性，U0126-H 组显著低于U0126-L 组（P＜0.05）。DMSO 组与OGD/R组差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

图4 U0126 对OGD/R 后细胞凋亡率的影响（n=3）

3 讨 论

本实验观察到在SH-SY5Y 细胞OGD/R 模型中，U0126 能提高细胞活性和SOD 活性，降低培养液LDH 活性和细胞的凋亡率。此结果与前期U0126 相关报道相一致。机体发生氧化应激时，SOD 活性降低，清除ROS 的能力下降［12］；在U0126处理后，细胞SOD 活性增加，清除OGD/R 产生的ROS 的能力增加，有助于细胞活性的提高。

课题组前期研究通过食管电刺激诱发心室颤动，建立大鼠全脑缺血再灌注模型，观察到大鼠复苏后脑部ROS 和MDA 水平增高，SOD 活性降低；在大鼠恢复自主循环后静脉注射PD98059，使p-ERK 蛋白表达量下降，有效降低ROS 和MDA 活性，提高SOD 活性，改善CA/CPR 后大鼠生存率、延长生存时间、改善神经功能［6-7］。因此可认为PD98059 是通过抑制ERK 通路激活，降低线粒体源ROS 活性，提高细胞抗氧化能力，起到保护作用。本次实验得出U0126 的抗氧化作用与课题组前期研究PD98058 在动物心跳骤停/心肺复苏模型中的作用是相符的。因此可认为在细胞OGD/R 模型中，U0126 的作用也与抑制ERK 通路激活相关。

课题组前期实验在SH-SY5Y 细胞OGD/R 模型中表明，U0126 降低cleaved-Caspase3 的表达量，抑制Caspase3 的激活，起到减少细胞凋亡的作用［11］；本实验通过流式细胞术PI 死染法直接检测各组细胞的凋亡率，结果显示U0126 可降低细胞的凋亡率，与前期的实验结果相符。

综上所述，ERK 抑制剂U0126 呈现出提高细胞的抗氧化能力、抵抗OGD/R 诱导的细胞损伤，且在一定范围内呈剂量依赖性，更多的作用机制还需要深入探索。