榛蘑多糖对酵母细胞氧化损伤的保护作用研究

白海娜

（吉林化工学院 生物与食品工程学院，吉林吉林 132022）

在氧化应激过程中，自由基被释放出来攻击生物体，包括其DNA、RNA、蛋白质等物质，最终引起细胞损伤、坏死或凋亡，导致机体紊乱和各种疾病，包括癌症、心血管疾病、糖尿病和衰老[1-3]。许多学者认为食物中的天然抗氧化剂比合成抗氧化剂更安全、更健康[4-5]。榛蘑是我国一种重要的药食两用真菌，富含多糖，是药品、食品工业共同关注的热点。据报道，榛蘑多糖有提高免疫力、抗肿瘤、降糖、抗突变和抗衰老等功效[6-9]。本课题建立紫外和H2O2氧化损伤酵母细胞的模型，研究榛蘑多糖对紫外和H2O2氧化损伤酵母细胞的作用，旨在评价榛蘑多糖抗紫外和抗H2O2氧化损伤的活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酵母菌由安琪牌高活性干酵母活化而得；榛蘑（吉林市大润发超市）；无水葡萄糖、酵母膏、琼脂粉、磷酸二氢钾、蛋白胨、磷酸氢二钠和过氧化氢（天津市凯信化学工业有限公司）。

1.2 仪器与设备

高压蒸汽灭菌锅；电子天平；折叠式恒温摇床；紫外光光度计；超净工作台；离心机；生物恒温培养箱。

1.3 试验方法

1.3.1 YEPD 培养基配制

（1）液体培养基配制方法。溶解10 g 酵母膏、 20 g 蛋白胨、20 g 葡萄糖于1 000 mL 水中，在温度为115 ℃的条件下灭菌。

（2）固体培养基配制方法。在液体培养基基础上，加入2%琼脂粉，在115 ℃条件下灭菌20 min。

1.3.2 酵母菌活化培养

（1）酵母菌活化。在无菌条件下，取1%酵母粉末加入已灭菌的5%葡萄糖溶液中，置于28 ℃摇床中振荡培养（转速200 r·min-1）活化3 h。

（2）酵母菌的YEPD 液体培养。按1%比例将酵母菌液转移到新培养基中，置于28 ℃摇床振荡培养（转速200 r·min-1）5 h，将酵母培养至对数期，冷藏保存。

1.3.3 榛蘑多糖的提取方法

取适量的榛蘑干粉加入5 倍体积的水，在恒温水浴锅70 ℃提取2 h，同样方法提取3 次，过滤提取液，合并滤液，浓缩至原体积的1/5，用4 倍体积95%的乙醇沉淀2 次，沉淀用无水乙醇、丙酮和乙酸乙酯各洗涤1 次，干燥，得到榛蘑多糖提取物。

1.3.4 榛蘑多糖对酵母细胞的毒性试验

（1）收集菌体。将酵母菌在液体YEPD 培养基中培养至对数期，取10 mL 菌液于20 mL 已灭菌的离心管中，用离心机4 000 r·min-1离心5 min，倒掉上清液，收集菌体。用磷酸盐缓冲液（pH=6.9）洗1 ～2 次， 加入10 mL 磷酸缓冲液悬浮其中得酵母菌悬液。

（2）梯度稀释。将处理后菌液摇匀后进行梯度稀释（最终稀释浓度为104）。

（3）正常对照组。取稀释后的菌液1.9 mL 加入 0.1 mL YEPD 液体培养基，分别移取100 μL 于3 个平行固体YEPD 培养基中，随后用涂布器涂布。

（4）样品组。取稀释后的菌液1.9 mL 加入 0.1 mL 的榛蘑多糖样品（AMP-1、AMP-2、AMP-3），3 组榛蘑多糖的终浓度分别为0.3 mg·mL-1、 0.6 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1。 各 取100 μL 于 固 体YEPD 培养基中，最后用涂布器涂匀。

（5）细胞培养。将涂布好的所有培养皿放入 28 ℃的恒温培养箱中倒置培养48 h，菌落计数。按式（1）计算酵母细胞存活率。

式中：Ai为样品组酵母单菌落数，CFU·mL-1；Ao为正常对照组酵母单菌落数，CFU·mL-1。

1.3.5 榛蘑多糖对紫外损伤酵母细胞的保护作用（1）收集菌体和梯度稀释方法同1.3.4。

（2）模型组。取稀释后的菌液1.9 mL 加入 0.1 mL YEPD 液体培养基，在致死条件为20 W、距离30 cm、60 s 下进行紫外处理，分别移取100 μL于3 个平行固体YEPD 培养基中，用涂布器涂布。

（3）正常对照组。同1.3.4 项（3）。

（4）样品组。取稀释后的菌液1.9 mL 加入0.1 mL 的榛蘑多糖样品（AMP-1、AMP-2、AMP-3）为样品组，3 组榛蘑多糖的终浓度分别为0.3 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1，在致死条件为20 W、距离30 cm、60 s 下进行紫外处理，分别移取100 μL于固体YEPD 培养基中，最后用涂布器涂匀。

（5）细胞培养。将最终涂布好的培养皿放入 28 ℃的恒温培养箱中倒置培养48 h，菌落计数。按式（2）计算酵母细胞存活率。

式中：Ai为样品组酵母单菌落数，CFU·mL-1；Aj为模型组酵母单菌落数，CFU·mL-1；Ao为正常对照组酵母单菌落数，CFU·mL-1。

1.3.6 榛蘑多糖对H2O2损伤酵母细胞的保护作用

（1）收集菌体和梯度稀释方法同1.3.4。

（2）模型组。取稀释后的菌液1.9 mL 加入0.1 mL 含有H2O2的YEPD 液体培养基，使H2O2终浓度达到2 mmol·L-1，在28 ℃的恒温培养箱中温浴1 h，分别移取100 μL 于3 个平行固体YEPD 培养基中，用涂布器涂布。

（3）正常对照组。取稀释后的菌液1.9 mL 加入 0.1 mL YEPD 液体培养基，在28 ℃的恒温培养箱中温浴1 h，分别移取100 μL 于3 个平行固体YEPD培养基中，随后用涂布器涂布。

（4）样品组。取稀释后的菌液1.9 mL 加入 0.05 mL 的榛蘑多糖样 品（AMP-1、AMP-2、AMP-3）为样品组，3 组榛蘑多糖的终浓度分别为 0.3 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1， 再加入0.05 mL 含有H2O2的YEPD 液体培养基，使H2O2终浓度达到2 mmol·L-1，在28 ℃的恒温培养箱中温浴1 h，各取100 μL 于固体YEPD 培养基中，最后用涂布器涂匀。

（5）细胞培养。将最终涂布好的培养皿放入 28 ℃的恒温培养箱中倒置培养48 h，菌落计数。按1.3.5 中式（2）计算酵母细胞存活率。

2 结果与分析

2.1 榛蘑多糖对酵母细胞的毒性作用

由表1 可知，终浓度为0.3 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、 1.2 mg·mL-1的榛蘑多糖均未见对酵母细胞产生毒性作用。

表1 榛蘑多糖对酵母细胞的毒性作用

2.2 榛蘑多糖对紫外损伤酵母细胞的保护作用

2.2.1 紫外损伤酵母细胞模型的建立

对酵母菌进行紫外线照射，每间隔20 s 对其检测菌落数，并计算存活率，紫外线照射时间对酵母细胞存活率的影响结果见图1。随着照射时间的增长，酵母细胞的存活率不断下降。照射时间较短时，存活率变化不明显；照射时间较长时，存活率较低。最终选用60 s 作为建立紫外照射对酵母细胞存活率影响模型的最佳时间。

图1 紫外线照射时间对酵母细胞存活率的影响

2.2.2 榛蘑多糖对紫外损伤的酵母细胞的保护作用

正常对照组、模型组、样品组酵母细胞存活率结果如表2 所示。与正常对照组相比，模型组的存活率显著降低，紫外辐照对酵母细胞具有显著损伤。与模型组相比，加入浓度为0.6 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1榛蘑多糖的样品组存活率显著增加，表明浓度为 0.6 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的榛蘑多糖对酵母细胞有显著的保护效果，榛蘑多糖的浓度越高对酵母细胞的保护作用越强。

表2 榛蘑多糖对紫外氧化损伤酵母细胞的保护作用

2.3 榛蘑多糖对H2O2 损伤的酵母细胞的保护作用

2.3.1 H2O2损伤酵母细胞模型的建立

由图2 可知，H2O2浓度较低时，酵母细胞的存活率变化不明显；H2O2浓度较高时，酵母细胞的存活率下降较多。随着H2O2浓度的不断增加，酵母细胞的存活率不断下降。最终选用2 mmol·L-1作为建立H2O2损伤对酵母细胞存活率影响模型的最适浓度。

图2 H2O2 浓度对酵母细胞存活率的影响

2.3.2 榛蘑多糖对H2O2损伤的酵母细胞的保护作用

正常对照组、模型组、样品组酵母细胞存活率结果如表3 所示。与正常对照组相比，模型组的存活率显著降低，H2O2对酵母细胞具有显著损伤。与模型组相比，加入终浓度为0.6 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的榛蘑多糖的样品组存活率显著增加，表明浓度为 0.6 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的榛蘑多糖对酵母细胞有保护效果，榛蘑多糖的浓度越高对酵母细胞的保护作用越强。

表3 榛蘑多糖对H2O2 氧化损伤酵母细胞的保护作用

3 结论

中 浓 度（0.6 mg·mL-1）、高 浓 度（1.2 mg·mL-1）榛蘑多糖对紫外和H2O2氧化损伤酵母细胞具有一定的保护作用，且随着浓度的增大对酵母细胞的保护作用增强，浓度为1.2 mg·mL-1的榛蘑多糖对紫外和H2O2氧化损伤酵母细胞保护作用较强。