基于网络药理学探讨复方伤痛胶囊治疗骨折的作用机制研究

周霖，王肖辉，李砺锋，金建文，武婧，孙志，左莉华，赵杰▲，付智慧

(1.郑州大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450052；2.郑州大学第一附属医院 超声科，河南 郑州 450052；3.陕西丽彩药业有限公司，陕西 咸阳 712000；4.郑州大学第一附属医院 中医药学部，河南 郑州 450052)

骨折(Fracture)是指骨的完整性或连续性中断，畸形、反常活动、骨擦音或骨擦感是本病的典型症状。临床表现包括疼痛与压痛、局部肿胀与瘀斑、功能障碍等，严重者可发生休克，甚至危及生命[1]。骨折可发生于不同年龄段，多见于儿童及老年人，中青年也时有发生[2]，是影响患者生活质量的重要因素之一。

复方伤痛胶囊，由当归、桃仁、红花、醋延胡索、大黄、柴胡、天花粉、甘草组成，具有活血祛瘀，行气止痛的功效，用于急性胸壁扭挫伤之瘀滞证，也可用于骨折血瘀气滞症[3-6]。由于中药是多组分、多靶点、多途径协同作用构成的复杂体系，传统的药物研究模式很难阐明其作用机制，是当前中医药走向国际世界的关键技术壁垒。网络药理学可利用多种数据库收集、整合研究材料，通过先进的数据处理方式，构建网络水平的中药分子及靶点、通路机制，是解决当前中药研究难题的重要关键技术[7]。

有文献[8]表明，复方伤痛胶囊具有调节骨组织修复及再生作用，能改善病变组织血液循环，防治瘀血阻塞加重病情，同时也能促进肉芽细胞、骨小梁、骨组织的增长，从而加快骨折的愈合，但从系统、全面、整体的角度对药物的主要药效物质成分及具体作用机制进行研究的报道较少，存在一定的不足。本研究前期采用质谱技术鉴定出复方伤痛胶囊中36个化学成分，并基于这些成分开展初步的网络药理学研究[9]。但限于当前分析技术的局限性，并未将药物中所有的化学成分进行识别，识别到的物质主要是含量相对较高的物质，然而许多痕量物质也是中药发挥治疗作用的主要物质基础，因此，此前研究可能存在一定的片面性。本研究拟基于庞大的网络数据库，更加系统全面地查找药物成分，以期能够多角度、多层次深入挖掘药物治疗复杂疾病的关键物质及潜在作用机制。

本文采用网络药理学的方法，较为系统地筛选出复方伤痛胶囊治疗骨折活性成分及作用靶点，构建“药物-活性成分-靶点”“活性成分-重要靶点-关键通路”网络，系统探究药物、活性成分、靶点、通路的内在关联机制，明确复方伤痛胶囊治疗骨折的主要药效成分、重要靶点和关键通路，为复方伤痛胶囊的临床应用、质量标准提升以及进一步的药理作用验证研究提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件

Uniprot(https://www.uniprot.org/);TCMSP(http://tcmspw.com/index.php);DrugBank(https://www.drugbank.ca/);OMIM (http://www.omim.org);Genecards(https://www.genecards.org);Omicshare 云平台(https://www.omicshare.com/);String(https://string-db.org/);DAVID(https://david.ncifcrf.gov/);Cytoscape 3.7.2软件。

1.2 复方伤痛胶囊活性成分的筛选

通过TCMSP数据库检索复方伤痛胶囊各药物的化学成分，并以OB≥30%和DL≥0.18[10-11]为限定条件对成分进行初步筛选；并通过查找相关文献补充TCMSP数据库未收录的成分，得到药物的主要活性成分及作用靶点。

1.3 复方伤痛胶囊活性成分作用靶点获取

通过TCMSP数据库得到以上活性成分对应的靶标蛋白，将靶标蛋白通过UniProt数据库、DrugBank数据库检索查询其对应的基因名称。

1.4 复方伤痛胶囊治疗骨折的潜在靶点预测

在OMIM数据库、Genecards数据库输入“fracture”，检索获得骨折的作用靶点。使用OmicShare云平台中的维恩图软件，将药物预测的靶点与疾病的靶点进行映射，获得复方伤痛胶囊治疗骨折的潜在作用靶点。

1.5 “药物-成分-靶点-疾病”网络构建

将中药材、活性成分及1.4项下所得的骨折潜在作用靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，分析网络拓扑性质，采用network analyzer插件进行数据处理。

1.6 蛋白相互作用网络构建

将1.4项下潜在靶点导入String数据库，勾选 multiple proteins，物种选择Homo sapines，构建蛋白相互作用(PPI)关系图。

1.7 Go富集分析和KEGG通路分析

为了进一步了解复方伤痛胶囊治疗骨折的潜在靶点基因功能及作用，将所得靶点导入DAVID数据库，设置P<0.05，物种为Homo Sapiens，并将靶基因名称校准为官方通用名称(Official Gene Symbol)，进行GO和KEGG分析，最后按照其富集的靶点数目依次进行排序，选取排名靠前的10个条目绘制条形图。GO富集分析选取(Biological Processes,BP)、(Molecular Function,MF)、(Cellular Component,CC)分别进行分析。

2 结果

2.1 复方伤痛胶囊的活性成分

通过TCMSP数据库，设定OB≥30%、DL≥0.18，筛选出符合条件的化合物，检索到大黄有效成分16个，当归2个，柴胡17个，天花粉2个，桃仁23个，红花22个，醋延胡索49个，甘草92个，去除共有成分，共计209个。

2.2 复方伤痛胶囊活性成分作用靶点

通过UniProt数据库、DrugBank数据库，检索到大黄潜在作用靶点65个，当归潜在作用靶点49个，柴胡潜在作用靶点128个，天花粉潜在作用靶点3个，桃仁潜在作用靶点49个，红花潜在作用靶点165个，延胡索潜在作用靶点131个，甘草潜在作用靶点170个，去除重复靶点，共计238个。

2.3 复方伤痛胶囊治疗骨折的潜在靶点

通过OMIM 数据库、Genecards数据库输入“fracture”，检索、筛查并整合后共得到骨折作用靶点5 381个。使用OmicShare云平台中的维恩图软件，将复方伤痛胶囊预测的靶点与骨折的靶点进行映射，获得复方伤痛胶囊治疗骨折的潜在作用靶点159个(见下图1)。

图1 复方伤痛胶囊治疗骨折潜在靶点维恩图

2.4 “药物-活性成分-靶点”网络模型及分析

采用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-活性成分-靶点”网络模型(见下图2)。该网络共有351个节点(包括173个靶点节点，178个活性化合物节点)，共有2 265条边(每条边代表活性化合物与靶点基因之间的相互作用关系)。由图可见复方伤痛胶囊中各药物之间存在各种相互作用关系，同一成分对应不同的靶点，不同成分也可对应同一靶点，形成复杂的作用网络，也充分体现了复方伤痛胶囊治疗骨折的多成分、多靶点治疗机制。

图2 “药物-活性成分-靶点”网络模型

2.5 蛋白相互作用(PPI)网络

将复方伤痛胶囊治疗骨折的159个作用靶点导入string数据库，保存其TSV格式文件。除去两个逸出靶点，将文件中的node1，node2，combined score信息导入Cytoscape 3.7.2 软件，绘制PPI网络，并进行Network Analyze分析。如图3所示，网络中共包含157个节点(节点代表靶点)，2 706条边(边代表靶点之间的相互作用)，网络中节点平均度值是34.5(度值表示连接到1个节点的线条数，线条越多表示关联度越大，故可以评估网络中每个节点的重要性)。图中节点越大、颜色越深，则表明度值越大，大于平均度值的靶点有61个(居于图3中间圆形的节点)，分别为AKT1、ALB、IL6、MAPK3、TP53、TNF、VEGFA、JUN、MAPK1、CASP3、EGFR、MMP9等。

图3 复方伤痛胶囊治疗骨折的PPI网络

2.6 Go功能富集和KEGG通路分析

将以上靶点导入DAVID数据库，共得到GO富集条目266个，其中生物过程(BP)195个，分子功能(MF)42个，细胞组分(CC)29个；其中，BP方面与骨折相关的生物过程有22条，选取BP与骨折相关的十个条目、MF与CC排名前十位的条目，分别绘制条形图，见图4。BP主要富集在ERK1和ERK2级联的正调控、炎症反应、对平滑肌收缩的调节等；MF主要富集在蛋白质同源二聚化活性、同蛋白结合、蛋白质异源二聚体活性、血红素结合、MAP激酶活性等；CC方面，在胞质、细胞外空间、细胞核。KEGG通路分析结果，共得到信号通路119条，其中，与骨折密切相关的通路有22条，如图5所示。

图4 GO分析生物过程、分子功能、细胞组分情况

图5 KEGG 通路富集分析

2.7 “活性成分-重要靶点-关键通路”网络模型及分析

基于以上结果信息，整理出药物的活性成分、重要靶点和关键通路，导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“活性成分-重要靶点-关键通路”网络模型，如图6所示，并进行Network Analyze分析。该网络共有274个节点，1 509条边，平均度值是11.01。图中节点越大表明度值越大，大于平均度值的活性成分有21个，分别是木犀草素、山奈酚、槲皮素、甘草查尔酮A、β-谷甾醇、芒柄花黄素、黄芩素、柚皮素等；靶点有27个，分别是PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、F10、NOS2、PPARG等；信号通路有11条，分别是PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、FoxO信号通路、破骨细胞分化等。

图6 “活性成分-重要靶点-关键通路”网络

3 讨论

中药被广泛应用于治疗骨折、骨质疏松等骨科相关疾病，已有许多动物实验和临床试验证明中药可刺激骨再生和抑制骨再吸收，最终促进骨折愈合。骨折愈合是一个复杂的生理过程，伴有局部血肿和局部炎症的形成，愈合过程涉及成骨细胞的增殖、分化和基质矿化。因此，控制炎症、促进血液循环和刺激骨再生的药物能改善骨折愈合[12]。

基于中药多成分、多靶点的特殊性，为更加全面研究复方伤痛胶囊治疗骨折的作用机制，本研究通过网络药理学方法，系统构建复方伤痛胶囊的“中药材-活性成分-靶点”网络及“关键成分-重要靶标-映射通路”网络，并进行深入挖掘分析。最终经筛选得到药物的关键成分有木犀草素、山奈酚、槲皮素、甘草查尔酮A、β-谷甾醇、芒柄花黄素、黄芩素、柚皮素、异鼠李素等21个；关键靶点有PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、F10、NOS2、PPARG、MAPK14、ADRB2、CDK2、GSK3B等27个；映射的靶标通路为PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、FoxO信号通路、破骨细胞分化、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、神经营养因子信号通路、HIF-1信号通路、钙信号通路、NOD样受体信号通路、VEGF信号通路，共11条；涉及的生物过程主要有ERK1和ERK2级联的正调控、炎症反应、对平滑肌收缩的调节、血管内皮生长因子受体信号通路、对缺氧的反应、对受伤的反应、血管生成、MAPK级联的正调控、血管生成的正调控、成肌细胞分化的负调控等。

本研究筛选的许多关键成分、靶点、通路与骨折的发生及愈合密切相关，体现本研究的科学性与合理性。其中木犀草素具有抗骨关节炎、骨肉瘤、骨损伤的作用[13-14]；山奈酚可通过调节Ca2+代谢平衡，促进骨胶原生成，减少骨小梁丢失，从而起到健骨的作用[15]；槲皮素可促进骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化，是其促进骨折愈合的关键细胞机制[16]；β-谷甾醇可刺激卵巢颗粒细胞分化，进而增强成骨作用，其主要通过提高成骨细胞OPG与PDF比值，从而调节骨代谢平衡[17]；黄芩素、柚皮素具有抑制破骨细胞的形成以及抑制破骨细胞的骨吸收功能[18-19]；以上成分均能从不同层面去促进骨形成、抑制骨吸收，促进骨折愈合。

在骨折愈合修复过程中，骨痂及血管的生成具有至关重要的作用。本研究富集的关键靶点VEGF，主要参与纤维骨痂的转化、软骨骨痂、骨性骨痂及其成熟骨痂的各个时期，并在血管的形成、软骨的吸收与骨痂的改建的过程中起到关键作用，促进骨折的快速愈合[20]；同时，VEGF还能介导活化其下游的PI3K-Akt信号通路，活化的Akt在磷酸化后激活eNOS(内皮型一氧化氮合酶)，继而催化合成NO，而NO能够刺激血管舒张、血管重塑及血管的生成，有利于骨折的愈合[21]。同时，在骨折愈合过程中由于存在低氧环境，从而激活HIF信号通路，而VEGF作为HIF-1a最直接的靶基因之一可通过信号转导来调控血管生成和骨形成[22]。此外，胞外信号调节激酶(ERK)可诱导间充质干细胞形成骨表型，MAPK通路可刺激成骨基因和功能的表达；持续激活ERK2，促成骨细胞分化；磷酸化Smad-1，激活P38，促Alp表达及成骨细胞活化[23]。研究表明，钙信号通路会与ERK交互作用来发挥对成骨细胞的抗凋亡或促凋亡作用，防止骨量丢失，有利于骨折的修复愈合[24]。Fox O家族中的Fox O3a与细胞凋亡密切相关，Akt1可使Fox O3a磷酸化，p-Fox O3a可抑制Bim的表达，减少caspase-3，从而抵御氧化应激，最终起到抗成骨细胞凋亡的作用[25]。骨折愈合一方面需要清除破坏，另一方面需要再生修复，其本质就是骨折断端发生骨吸收、骨形成与骨重建塑型的过程。其中，成骨细胞介导骨形成，破骨细胞介导骨吸收，两者相互配合，在骨折愈合时，增强骨组织增殖形成，促使骨痂破坏清除，从而完成骨组织的再生修复[26]。本研究筛选的关键通路有保护成骨细胞存活及刺激破骨细胞活化的作用，是骨折愈后修复的关键作用环节。

复方伤痛胶囊的分子靶点治疗网络机制复杂，本研究通过构建“药物-活性成分-靶点”网络及“关键成分-重要靶标-映射通路”网络，经数据系统分析后，筛选出核心活性成分及作用靶标，并进行生物学信息分析，预测复方伤痛胶囊治疗骨折的复杂机制，为进一步的后续药理研究奠定了扎实的前期基础，也为更高效探究中药治疗复杂疾病的作用机制提供了科学的思路和方向。